1 範圍
本方法采用乳糖發酵法測定醬油中大腸菌群的 MPN值。
本方法適用於醬油中大腸菌群的測定，以 MPN/100mL報告其結果。
2 原理
大腸菌群係指一群能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞杆菌。
該菌主要來源於人畜糞便，故以此作為糞便汙染指標來評價食品的衛生質量，推斷食品中有
否汙染腸道致病菌的可能。
3 試劑
3.1 溴甲酚紫溶液，0.4g/L
3.2 乳糖膽鹽發酵管：將蛋白腖20g、豬膽鹽（或牛、羊膽鹽）5g及乳糖10g溶於1000 mL
水中，校正PH至 7.4，加入溴甲酚紫溶液25mL，混勻後分裝每管 10mL，並放入一個小倒管，115℃高壓滅菌 15min。
3.3 雙料乳糖膽鹽發酵管：將蛋白腖 40g、豬膽鹽（或牛、羊膽鹽）10g 及乳糖 20g 溶於 1000 mL水中，校正PH至 7.4，加入溴甲酚紫溶液50mL，混勻後分裝每管10mL，並放入一個小倒管，115℃高壓滅菌15min。
3.4 乳糖發酵管：將蛋白腖 20g 及乳糖 10g 溶於 1000 mL 水中，校正 PH 至 7.4，加入溴甲酚紫溶液 25mL，混勻後按檢驗要求分裝 30 mL 、10mL、3 mL，並放入一個小倒管，115℃高壓滅菌15min。
3.5 EC肉湯：將胰蛋白腖 20g、3 號膽鹽（或混合膽鹽）1.5g、乳糖5g、磷酸氫二鉀 4g、磷酸二氫鉀 1.5g 及氯化鈉 5g 混合，溶於 1000 mL 水中，溶解後分裝有發酵倒管的試管中，並放入一個小倒管，121℃高壓滅菌 15min，最終PH 為 6.9±0.2。
3.6 伊紅美藍瓊脂平板： 將蛋白腖 10g、 磷酸氫二鉀 2g 及瓊脂 17g 溶解於蒸餾水中, 校正PH至 7.1 分裝於燒瓶內， 121℃高壓滅菌 15min， 臨用時加入乳糖 10g 並加熱溶化瓊脂， 冷至 50～55℃，加入伊紅美藍溶液（6.5g/L）10 mL，搖勻，傾注平板。
3.7 革蘭氏染色液：
3.7.1 結晶紫染色液：將1g 結晶紫溶解於 20 mL乙醇（950g/L）中，然後與80 mL 草酸銨溶液（10 g/L）混合均勻。
3.7.2 革蘭氏碘液：將1g 碘與 2g 碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解後，再加蒸餾水至300mL。
3.7.3 沙黃複染液：將 0.25g 沙黃溶解於10 mL乙醇（950g/L）中， 然後用蒸餾水稀釋至 100mL。
4 儀器
4.1 溫箱：36±1℃
4.2 恒溫水浴：44.5±0.5℃
4.3 顯微鏡
5 操作步驟
5.1 樣品處理：用點燃的酒精棉球燒灼瓶口滅菌，用石碳酸紗布蓋好，再用滅菌開瓶器啟開後進行檢驗。
5.2 檢樣稀釋：以無菌操作，吸取醬油樣品25 mL，加入裝有 225mL滅菌蒸餾水的滅菌玻璃瓶內經充分振搖做成1:10 的均勻稀釋液。
5.3乳糖發酵試驗
將待檢樣品接種於乳糖膽鹽發酵管內，接種量分別為 10mL 、1mL、0.1 mL稀釋液，接
1種量在lmL以上者，用雙料乳糖膽鹽發酵管，lmI，及lmL以下者，用單料乳糖膽鹽發酵管。每一稀釋度接種3 管，置36 士l℃溫箱內，培養24士2h，如所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產氣者，則按下列程序進行。
5.4 分離培養
將產氣的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置 36 士 1℃溫箱內，培養18一24h，
然後取出，觀察菌落形態，並做革蘭氏染色和證實試驗。
5.5 革蘭氏染色試驗
將塗片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染 1min，水洗，然後滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗，再滴加乙醇（950g/L）脫色約30s，（或將乙醇滴滿整個塗片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個塗片，脫色 10s）水洗，最後滴加沙黃複染液複染 1min。水洗，待幹，鏡檢。
革蘭氏陽性菌呈紫色，陰性菌呈紅色。
5.6 證實試驗
在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落 1~2 個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發酵管，
置 36 士 1℃溫箱內培養 24 士 2h，觀察產氣情況。凡乳糖管產氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞杆菌，即可報告為大腸菌群陽性。
5.7 報告
根據證實為大腸菌群陽性的管數，查MPN檢索表，報告每 100mL大腸菌群的 MPN值。
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