腺病毒科培養與增值特性

  7.培養與增殖特性大多數腺病毒具有比較嚴格的宿主動物範圍。一種動物的腺病毒一般不感染異種動物。而且在組織培養細胞中，也以該宿主動物來源的細胞最為敏感，上皮樣細胞似乎比纖維樣細胞更為敏感。故在腺病毒的分離培養中，通常應用宿主動物來源的原代、繼代或傳代細胞(主要是腎細胞)。但在連續傳代後，常可適應其它動物來源的細胞培養物。腺病毒通過其纖突球部與敏感細胞膜上的特異性受體結合後，即開始了感染過程。結合後的病毒，或依靠細胞的吞飲作用，或直接侵入細胞。進入細胞漿內的病毒立即脫衣殼，五鄰粒發生解離，進而降低了衣殼的穩定性，其它六鄰粒及其相關蛋白也發生分離。裸露的病毒核心體通過核膜上的空隙進入核內，或釋放出DNA進入核內，這個過程可在1～2個小時內完成。病毒DNA在核內複製之前，病毒基因組的立即早期和早期mRNA即被轉錄。這些前期mRNA在感染後1～2小時即開始形成，2～3小時可以在細胞漿的核糖體上出現並翻譯成數種早期蛋白。胞核內的前期mRNA為高分子結構，但胞漿內卻主要是以16S和23S為主的mRNA。研究表明，在E1A啟動子控製下的RNA合成最早發現於病毒感染後1小時，而E1B、E2B、E3和E4的轉錄發生在感染後15～20小時。E1A、E3和E4轉錄在感染後3～4小時達到高峰，然後開始下降，而E1B和E2B在感染後6～7小時達到高峰，然後開始下降。DNA複製一開始，所有早期轉錄可增加3～10倍，這可能反映了DNA模板數量的增加。在感染的中期，也就是感染後8～12小時，Ⅸ和Ⅳa2啟動子最為活躍。主要晚期啟動子(MLP)和E2區的E2A的第二個啟動子控製的轉錄在這一時期開始增加。MLP在18小時達到高峰。其轉錄的RNA約占全細胞RNA的20%～30%，並至少在10小時內保持穩定。在感染後7～8小時，DNA合成的同時，後期mRNA開始轉錄。這些mRNA比較穩定，它們是翻譯成病毒粒子蛋白質的mRNA。構成病毒粒子的五鄰粒、六鄰粒和內部蛋白，都在DNA複製以後合成。六鄰粒和五鄰粒蛋白質的合成量比構成病毒衣殼的蛋白質的量要多得多。但合成內部蛋白的量並不比組成病毒內部蛋白的實際需要量多。多餘蛋白質的機能還不清楚，但其中肯定包括T抗原和P抗原。病毒的DNA複製為半保留複製，始於兩條鏈的任何一端C處，後者與前體末端蛋白(pTP)結合，成為pTPdCMP複合物，作為引物。pTPdCMP複合物有效的合成則需要其它二種病毒蛋白，一是病毒編碼的DNA聚合酶，一是病毒編碼的DNA結合蛋白，此外還有NF1蛋白，它的結合位點是TGG(N)67GCCAA。在感染後6～8小時，病毒DNA即在核內複製，18～20小時達到高峰，然後開始晚期轉錄，晚期mRNA也進入胞漿核糖體進行翻譯，再回到核內進行包裝，包裝時先形成一個原衣殼，這大約在衣殼蛋白產生2小時之後完成。複製的DNA進入原衣殼內，形成成熟的病毒粒子，再釋放到細胞外，釋放期可長達13～17小時。根據測定，DNA的生產量常是最終進入子代病毒粒子的DNA的10倍。組成病毒粒子，似乎需要高濃度的核酸和蛋白質。但病毒DNA轉錄物(mRNA)譯製病毒特異的早期蛋白質，是病毒DNA複製所必需的。而子代DNA的產生，又為後期轉錄物和後期病毒蛋白的形成創造條件。雖然腺病毒的DNA是在細胞核內複製和轉錄的，但是病毒蛋白是在胞漿的聚核蛋白體上生成的。後期蛋白質主要就是病毒粒子的結構蛋白。通常是在形成多肽鏈後就迅速運入細胞核內，以便與已在核內生成的子代DNA組裝成成熟的病毒粒子。成熟的病毒粒子經常在感染細胞核內形成結晶狀聚積，在細胞崩解時釋出於細胞外。在腺病毒的增殖周期中，DNA複製前為早期，DNA複製後為晚期，早期表達蛋白的主要功能是調節基因表達和DNA複製；晚期蛋白主要是病毒粒子成份和病毒包裝蛋白。一般也可將病毒複製周期分為早早(極)期、早期、中間期和晚期，各指感染後0～2、2～6、6～12、12～36小時。病毒感染後15～17小時，感染細胞內的病毒量增高。在感染後20小時左右，細胞外開始出現病毒，病毒量於感染後25～36小時達高峰。由於腺病毒對敏感細胞的吸附效率較低，且因病毒的釋放也不完全，因此細胞培養物在接種病毒以後，經常需待7～10天，甚至2～4周以後才能出現比較明顯的細胞病變。但犬和猴等腺病毒產生細胞病變較快(2～4天)。腺病毒增殖時，感染細胞的有絲分裂被阻斷，糖酵解增高，酸產量增多。因此感染腺病毒的細胞培養液變酸(這與感染其它病毒的細胞培養物不同，在這些細胞培養物內，當感染細胞破壞時，PH變堿)。此時，感染細胞變圓，且集聚成不規則的葡萄串狀。胞核內出現單個的大型嗜堿性包涵體。胞核增大，有時還可看到嗜酸性包涵體，包涵體內聚集有蛋白質和病毒粒子結晶。