6.5 轉染QBI-293A細胞
表現 可能原因 解決方法
無空斑 a） 製備的質粒質量差 用氯化銫密度梯度法純化用於轉染的質粒
b） 時間問題 棄去培養板之前先等2~3周或更長。空斑將在2~3周內逐漸形成，如果重組子高表達蛋白，這個過程將更慢
c） 轉染操作 用陽性對照來檢驗轉染效率
d） 細胞拮抗腺病毒 從細胞庫中複蘇另一管細胞
e） 病毒質粒未經 PacI線性化 閉環質粒不會形成病毒空斑，轉化前必須用PacI進行線性化
空斑太多 高轉染效率導致空斑密度過高 由於太多數被轉染細胞都將產生病毒空斑（79.5%），轉染時請使用較少量的腺病毒DNA
轉染後細胞高死亡率 a） 轉染後鈣離子未徹底去除 轉染後先後用PBS/EDTA和PBS各洗一遍，去除鈣離子
b）轉染後細胞經胰酶消化 細胞在轉染後非常脆弱，極易從壁上脫落。不要使用胰酶進行消化，這樣做不僅不必要，而且還可能導致活著的細胞死亡
覆蓋的瓊脂糖不清澈 瓊脂糖被汙染 使用無菌的瓊脂糖
6.6篩選和測定
表現 可能原因 解決方法無重組子 a） 挑中了背景空斑（即首先出現或最大的空斑） 挑空斑之前先等14~17天.
b） 達到或超過了載體的最大克隆能力 確認是否超過最大克隆能力；若有疑問請聯係技術支持（info@qbi.com）
c） 插入基因產物有毒 在293細胞中暫時性表達蛋白以評價氣度性。若有毒，請替換未可誘導或較弱的啟動子
d）插入基因缺失 重組時因某些未知原因可能導致基因缺失，應篩選較多的克隆
擴增後插入基因丟失 有RCA，當大量擴增時可能發生回複突變 1）檢測是否含有RCA或感染非允許細胞
2）聯係技術支持，請教如何檢測和限製這一現象
3）用原始病毒保存液重新空斑純化病毒
重組時將插入基因丟失 用原始病毒保存液重新擴增
6.7 在QBI-293A細胞中表達
表現 可能原因 解決方法
重組蛋白不表達 a）基因未插入重組病毒 用病毒保存液進行PCR反應，檢測是否含有目的基因
b）表達水平太低，所用方法無法檢測到 優化檢測蛋白表達的條件
蛋白表達水平太低 a）蛋白表達的克隆設計不夠優化，如非翻譯區太長、離啟動子太遠等等 選擇最佳蛋白表達克隆。這些因素在進行克隆設計時就應考慮到
b）啟動子不太適合在所用的細胞類型中表達蛋白 用另一類型細胞驗證蛋白表達情況
6. 8 重組腺病毒的擴增
表現 可能原因 解決方法
病毒溶液終濃度低 病毒增值速度慢，這和很多因素有關，如插入基因的大小、毒性和重組情況等等 1） 感染時間從48小時增加到72小時，以產生完全的CPE
2） 保證三次凍融都很完全
3） 如果需要，用更大的培養器皿和更多的細胞進行更大量的擴增（代數不能太多）
6. 9 純化
表現 可能原因 解決方法
第一次氯化銫離心後無條帶形成 a） 收集的細胞量太少
b）病毒量太多 1） 感染的細胞量不夠。至少需要3×108細胞，當病毒生長緩慢時則需更多細胞
2） 降低稀釋度
上樣量密度過大將使分離失效，適當稀釋上樣液
第二次氯化銫離心後無條帶形成 第一步操作不當導致病毒丟失 吸取病毒帶時必須非常小心，寧可吸到汙染的雜質也不要漏吸，第二步將會去除汙染的缺陷性顆粒第二次離心後條帶分離不清晰 a) 氯化銫密度梯度製備質量差
b) 離心問題 1） 連續密度梯度必須使用密度梯度發生器小心製備，離心前切勿將梯度打亂
2） 稀釋第一步中得到的病毒帶
3） 不要使用直徑比推薦值小的離心管，否則條帶將變大
檢查離心記錄，速度和時間都會影響分離效果
6.10 病毒滴度測定
表現可能原因 解決方法
OD260測得的滴度與空斑測定或TCID50測定獲得的滴度無相關性 a） 含有大量缺陷性顆粒
b） 稀釋錯誤
c） 細胞密度不夠 用兩次氯化銫離心純化病毒，去除缺陷性顆粒 精確測定滴度時，每個稀釋度都應有複孔，稀釋時必須換用槍頭
進行滴度測定時細胞必須50~60%匯合
無CPE或空斑 a） 保存液滴度太低，無法檢測到
b） 時間問題 1） 使用陽性對照，以確保方法和溶液的有效性
2） 降低保存液的稀釋度
在推薦時間內等待空斑形成和CPE出現 保存後滴度降低 緩衝液不對或儲存不當 1） 使用含2mMgcl2和5%蔗糖的10mM Tris緩衝液，PH8.0，PH值對於長期保存至關重要
2） 將病毒保存於-80℃，不主張長期保存於-20℃
3） 將病毒分裝成小份，以免反複凍融後降低滴度
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