重組腺病毒的篩選和純化

  腺病毒轉移載體和腺病毒DNA通過在體同源重組產生重組腺病毒，這涉及到複雜的反應和基因重排或突變，導致病毒呈現不同的表型。雖然重組腺病毒DNA在細菌內重組後已篩選到含有插入基因，但我們還是建議按照下麵的操作步驟對細胞內產生的重組腺病毒進行鑒定。

 

5.5.1 挑選最佳重組腺病毒：表達和基因輸送

重組腺病毒的挑選取決於病毒表達蛋白和增殖的能力。比如有兩個不同特性的克隆，第一個克隆蛋白表達很好而且病毒可增殖至5000VP/細胞，而第二個克隆雖然蛋白表達水平隻達到第一個克隆的75%，但是卻可以增殖到10000VP/細胞。擴增的時候，第二個克隆10L產量中的病毒數量即可達到第一個克隆20L的產量，這樣當需要大量擴增病毒時第二個克隆是較好的選擇，而且產物足以產生生物學效應。篩選方法的選擇取決於病毒最終的應用。如果用於蛋白表達，那麽必須使用能監測蛋白表達水平的方法；如果要挑選能有效擴增的克隆，那麽就用能定量檢測DNA產量的方法。簡單的重組腺病毒篩選可用PCR方法，這一技術隻檢測病毒中的重組DNA，而不能篩選特定的表型。其它技術不但能篩選重組病毒，同時也能挑選特定的表型。克隆的挑選可根據：

1. 每個細胞產生病毒的數量。這可以用Southern雜交的方法，因為病毒DNA量與每個細胞的病毒含量有關。能產生高水平病毒量的克隆有利於生產高滴度的病毒儲存液，但是增殖最佳的克隆未必能最有效地表達蛋白。

2. 每個細胞蛋白表達的水平。這可以用Western雜交或功能測定的方法。

請注意有些最佳克隆可能會較難培養。因此篩選方法的選擇取決於用來觀察生物學效應的蛋白表達水平和重組腺病毒的最終應用。

表4提供了選擇最佳篩選方法的向導。報告基因、表達蛋白的抗體和功能測定的敏感性將影響操作方法的選擇。得到最初結果的時間對方法的選擇也很重要，但這一原則必須慎重考慮，因為如果最終目的是生產大量病毒，那麽一個10倍量高產的克隆隻需擴增1L即能達到原來10L的病毒量，這時使用快速篩選方法所節省的時間會在大量擴增過程中完全耗費掉。

表4：各種篩選方法的特性 

篩選方法 優點 缺點

Western雜交顯示表達蛋白的完整性 顯示插入基因的蛋白表達水平 

 可以用與其它蛋白有交叉反應的抗體，因為蛋白會在膠上得到分離 需要表達蛋白的抗體得到最終結果需兩個星Southern雜交 或點雜交使用克隆基因作為探針,無須特殊試劑 通過信號強弱間接測定每個細胞內的病毒數量 需從病毒儲存液中額外擴增，整個流程需要一周時間僅能檢測克隆的基因 PCR迅速，使用擴增病毒的儲存液隻需1天時間 僅能檢測克隆的基因且無法定量 ，可能需要優化克隆基因的PCR條件免疫測定相對快速，總共需要3天時間，顯示插入基因的蛋白表達水平需要與細胞蛋白無交叉反應的特異性抗體

功能測定直接顯示蛋白的完整性和功能 需從病毒儲存液中額外擴增，整個流程需要一周時間對於大多數方法來說，信號密度與蛋白的表達水平、病毒DNA的增殖程度以及病毒保存液的純度有關。空斑總量中的陽性率提示克隆的純度高低。比較不同克隆間的信號密度水平時克隆的純度非常重要，也就是說必須保證所有篩選出來的空斑必須100%陽性。

5.5.2病毒空斑挑選和小量擴增 VKAo zOV P 

通過AdEasyTM係統純化得到的細菌克隆而產生的病毒空斑應該幾乎都是（95%）重組病毒。每個細菌克隆最好測定至少1~2個空斑的表型。

操作步驟

1. 從培養板上挑選6~12個空斑，標上圓圈。

2. 無菌條件下用200μL槍頭挑出克隆並轉入含0.5mL DMEM5%/孔的24孔板。 

3. 37℃病毒24小時。

4. 鋪一塊每孔含1×105 QBI-293A細胞的24孔板。

5. 移去培養液，輕輕加入100μL步驟3中清洗的病毒（約103病毒顆粒），切勿將細胞吹起，十字型輕輕晃動3次，轉入CO2孵箱37℃培養90分鍾。

6. 加入DMEM5%，使總體積為1mL，輕輕混勻。

7. 37℃ CO2孵箱培養直至完全出現CPE，在此MOI值下一般需要5~10天。如果10天後還沒出現CPE，說明此克隆的病毒量太低，需要進行第二輪擴增。

8. 為從細胞中釋放病毒，在-20℃和37℃中充分凍融細胞3次。

9. 收集細胞，在15mL離心管中打碎。台式離心機上以最大轉速離心10分鍾，收集上清並儲存於-80℃。這一凍存液中大約有5×107VP/mL。如步驟7中所述，如果在第一次擴增後CPE不完全，則進行第二輪擴增。由於QBI-293A細胞含有腺病毒基因組的E1區，因此E1區缺失的腺病毒與人染色體發生同源重組而產生有增殖能力的腺病毒（RCA）的機率很低。

發生這種回複突變的機率大約為1/107，這種腺病毒的增殖速度比重組腺病毒快。首輪擴增產生的腺病毒保存液是十分重要的，因為它含有RCA 的可能性最低。這種保存液必須節約使用，並保存好所有低代病毒，以便進行大量擴增，不可用已傳過數代的病毒進行大量擴增。低代病毒DMEM5%溶液可在-80℃條件下保存數年。所以，保存好低代病毒可避免進行重複篩選和純化病毒克隆的工作。

在這一期間可以選擇適當的方法來篩選重組病毒，當所有病毒空斑100%為正確的重組病毒時可以認為這個克隆為純的。如果此時病毒仍然不純，則可以進行第二輪空斑純化，然後再用適當方法進行篩選。

 

5.5.3 Western 雜交

以下內容提供了進行Western雜交的一般指導。按照本手冊製備的初次病毒擴增保存液已足夠用來檢測大多數腺病毒蛋白，SDS-PAGE、抗體反應和檢測係統的具體操作請參考標準實驗手冊。

1. 在5×105細胞/孔的24孔板中每孔加入500μL DMEM5%培養液，然後再每孔加入200μL初次病毒擴增保存液感染48小時。

2. 確證所有細胞均出現CPE，如果CPE不完全則再延長感染24小時。

3. 取出400μL轉入1.5mL試管中，其餘-80℃凍存。 

4. 800rpm離心5分鍾，棄上清後用20μL PBS重懸細胞，用P20移液槍充分混勻重懸細胞。

5. 加入20μL 2 × Laemmli緩衝液（注意：對於某些蛋白和抗體，這一步使用不含巰基乙醇的緩衝液至關重要）。

6. 煮沸5分鍾。

7. SDS-PAGE上樣。

不同克隆抽提物中的蛋白含量變化很大，上樣量勿過量。在顯微鏡下先測定每個樣品的蛋白含量對於獲得好的結果十分重要，每孔的蛋白上樣量大約為5~10μg。

 

5.5.4 Souther雜交和點雜交

1． 六孔板中加入2×106 QBI-293A細胞，然後加入含500-10

5.5.5病毒裂解產物PCR

理論上講，這是篩選重組病毒最快的方法，但是很難預料一對引物能否正常工作，因此常常需要優化PCR條件。如果把優化PCR條件的時間也計算在內，那麽獲得最終結果需要的時間可能和其它定量方法差不多。PCR反應可直接用初次擴增得到的病毒保存液進行（5.5.2，第9步）。一個25ul反應體積的標準PCR反應需要4ul病毒保存液（無需抽提），25pM引物和1單位Taq酶，取5-10ul進行電泳分析。標準的PCR過程請參考通用的分子生物學手冊。如果PCR擴增無效，則反應前需象Souther雜交一樣抽提DNA（Hirt法）。其實，每個克隆用酶切反應進行分析更為合適，因為盡管酶切和PCR需要相同的時間，但酶切分析更能確認重組病毒的序列結構。

 

5.5.6 免疫

這是最快的篩選方法。免疫測定可直接在培養孔進行，一天內即可完成。但這方法需要特異的抗體，而且無法定量。具體操作請參考相應的標準免疫測定方法。

1． 如5.2.1中所述，用初次擴增的病毒保存液感染細胞。 

2． 4%多聚甲醛固定感染的細胞20分鍾，PBS洗2次，如果需要可用0.075%曲拉通/ PBS滲透，PBS洗2次以上，2%BSA阻斷60分鍾。

3． 加入一抗37℃培養60分鍾。

4． PBS洗兩次。

5． 加入標準的二抗（FITC，緘性磷酸酶，辣根過氧化物酶等）進行孵育。  

6． 用相應方法進行蛋白顯色。

5.5.7 功能測定

有些蛋白的功能可直接進行測定。如果目的是進行蛋白表達，那麽建議用評價蛋白功能的方法來篩選病毒，必須應用能準確評價蛋白質量的方法，操作應視需要進行相應調整。以下是分離含有完整蛋白的被感染細胞的一般方法：

1． 在每孔含5×105細胞的24孔板中，每孔加入700ul含200ul首次病毒擴增保存液（5.5.2，第9步）的DMEM5%，培養48小時。

2． 觀察細胞直至完全出現CPE，如果CPE不完全，再延長感染24小時。

3． 取出400ul轉入1.5ml離心管中，將剩餘的300ul凍於-80℃。