AdEasyTM重組質粒的篩選和擴增

  將侯選重組子進行酶切分析，驗證其結構。比如：PacI酶切後通常得到約30kb的片段和一個3.0或4.5kb的小片段。小片段的大小因重組位置在左臂還是複製子而不同。建議同時用克隆基因的內切酶進行分析，鑒定是否含有插入基因。挑選最佳陽性重組子轉入DH5α中進行擴增：轉化DH5α隻需1-5ul小量製備的重組子。這一步對於擴增時保持重組DNA的結構是必需的，因為AdEasyTM這樣的大質粒在recA+細菌株如BJ5183中是不穩定的，會迅速出現缺失,而在DH5α中能很容易地獲得大量DNA。

1． 將DH5α感受態細胞和電穿孔杯置於冰上。

2． 將1-5ul DNA加入40ul DH5α感受態細胞中，DNA必須用水溶，避免含有離子。

3． 將DH5α感受態細胞轉入2mm電穿孔杯，防止形成氣泡。

4． 按照說明轉化DH5α：Bio-Rad儀器一般使用的參數為：200 Ohms、25uF、2.5KV；BTX儀器則為：50 Ohms、2.5KV、C=0。

5． 將轉化混合液重懸於1ml LB中。

6． 轉入15-50ml離心管中，37℃振蕩培養60分鍾。

7． 培養後用LB按一定梯度稀釋轉化的DH5α（1:10、1:100和1:1000）

8． 取100ul轉化液鋪在LB/Kan（50ug/ml）板上，37℃培養24小時。未用的轉化液可在4℃保存-2周。

9． 每個重組子挑1~3個克隆轉入5ml LB擴增，以備有足夠量質粒。這時，用內切酶再次分析重組DNA，以確證含有插入基因，以及重組子的穩定性。 

10． 用柱純化試劑盒製備至少5ug高質量的重組DNA。