3.1 技術概覽
AdEasyTM係統是由T.C.He等（1998）構建的用來代替傳統腺病毒重組係統的一個快捷係統。在這個係統中，隻需二步即可產生重組腺病毒：先將表達盒裝入轉移載體，然後再通過同源重組插入腺病毒基因組。將外源基因插入腺病毒的最有效途徑是通過同源重組，原因是：1）腺病毒DNA是大型的線性分子，含有幾乎所有的內切酶切位點；2）基因組過大（36kb），難於操作。在AdEasyTM載體係統中，含有大部分腺病毒基因組的載體為超螺旋質粒，而不是線性DNA，同源重組則在大腸杆菌進行。相對於傳統係統而言，這二點改進使病毒DNA操作更容易，同時由於利用了大腸杆菌的高效率同源重組特性而使重組載體的篩選更為簡單。在本係統中，首先將基因cDNA插入一個轉移載體，將得到的質粒用PmeI線性化，然後在大腸杆菌BJ5183中與病毒DNA質粒pAdEasy-1進行同源重組。pAdEasy-1缺失了E1和E3區，其E1區功能將在293A細胞中得到互補。重組子通過卡那黴素篩選，用內切酶進行鑒定分析。最後將得到的重組腺病毒用PmeI線性化，暴露其反向末端重複序列（ITR，Iaverted Termined Repeats），轉染QBI-293A細胞後產生重組病毒顆粒。 同源重組在線性化的轉移載體和完整的超螺旋腺病毒質粒之間進行。應用完整的腺病毒質粒而不用內切酶進行線性化，對於產生重組腺病毒至關重要。轉移載體中的卡那黴素抗性基因則可用來篩選重組子。由於線性化的轉移載體產生卡那黴素抗性克隆的背景較低，因此此同源重組係統有較高的信噪比。大腸杆菌BJ5183有recA活性，但同時缺失介導細菌重組的其它酶，具有高效的轉化和重組能力。一旦重組子經確定，則可轉入普通的無recA、endA活性的細菌株如DH5α等進行擴增。由於缺乏recA活性，DH5α不能用於腺病毒的同源重組。
3.2 Ad EasyTM係統中產生重組腺病毒的時程 與傳統係統相比，AdEasyTM係統中篩選和純化腺病毒所需的時間大大縮短了。克隆和篩選約需1-3周，重組後需驗證重組病毒質粒是否含有目的基因。重組子在DH5α中擴增後轉入哺乳動物細胞293A，最後將293A細胞中產生的重組病毒顆粒進行純化和滴定。最終得到的重組腺病毒隻能在提供E1區功能的293A細胞中進行增殖。一般來說，用傳統方法產生重組腺病毒並不需要大量工作，每天隻需1小時進行細胞傳代和觀察空斑形成。但由於病毒空斑形成速度慢，整個過程就需要很長時間。而AdEasyTM載體係統用大腸杆菌產生重組病毒，大大縮短了所需時間。我們強烈建議初學者用QBI-Infect＋陽性對照進行感染力測定（見5.2.2）。進行這些測定之前，必須先擴增QBI-293A細胞。感染力測定使你能觀察到病毒增殖導致的細胞表型的改變，獲知你所用細胞對腺病毒的敏感性，而病毒空斑測定可讓你觀察到病毒空斑的形成。
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