摘要 [目的] 探討蟹味菇高產栽培技術。
[方法」通過實驗室內子實體組織分離培養獲得健壯的菌種，並對菌種進行純化、保存，采用深層培養方法進行液體發酵。
[結果]結果表明，蟹味菇較易進行組織培養，汙染率小，可獲得優良菌株；蟹味菇胞外高產木聚糖酶，但不分泌漆酶。
[結論] 該研究為蟹味菇的深入研究提供相關地基礎資料。
關鍵詞:組織培養,深層培養,分泌
蟹味菇，又稱玉覃、真姬菇，隸屬擔子菌綱、傘菌目、白菇科、離摺傘族、玉覃屬。蟹味菇菇形美觀，質地脆嫩，因具有獨特的蟹鮮味而賦之其名。組織分離是通過食用菌子實體的部分組織來獲得純菌種的技術，是獲得優良菌種的一種有效、簡便的方法。
木聚糖酶是指可以將木聚糖催化水解成低聚木糖或木糖的酶係總稱，包括多種內切酶和外切酶。內切β-1 ，4-D 一木聚糖酶，簡稱木聚糖酶，是木聚糖降解酶係中最關鍵的酶，它在食品、飼料、造紙等行業具有廣闊的應用前景。
漆酶廣泛存在於真菌特別是擔子菌中，是一種含銅的酚氧化酶。它可以氧化降解多種酚類化合物及有機磷毒物圖，因此，在許多方麵有較大的應用價值，比如用於改善油漆的性能，處理含酚汙水，改進造紙工藝，用於環境監測，酶法合成化合物等。大量資料表明，對蟹味菇的研究大都停留在外界條件對菌絲生長的影響和探討高產栽培技術方麵，對蟹味菇組織分離培養和發酵產物的研究報道很少，因此，筆者研究了蟹味菇組織培養及分泌胞外酶，旨在為蟹味菇的深人研究提供相關基礎資料。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菇體。新鮮蟹味菇子實體（上海浦東天廚菇業有限公司），購自學校附近利群超市。
1.1.2 試劑。木聚糖；鄰聯甲苯胺，上海化學試劑總廠生產，分析純；其他化學試劑，均為分析純或化學純。
1.1.3 儀器。722E 型可見分光光度計（上海第三分析儀器廠）, 756MC 可見分光光度計（上海第三分析儀器廠，光學顯微鏡（上海第三分析儀器廠）。
1.1.4 培養基。
1.1.4.1 綜合馬鈴薯固體培養基（g/L ）。馬鈴薯200，葡萄糖20，KH2PO4 3 , MgSO4 1.5 , VB1 0.01 ，瓊脂20 。
1.1.4.2 測木聚糖酶的液體培養基（g/L ）。馬鈴薯200 ，麥麩20 , KH2PO4 3 , MgSO4 1.5 , VB1 0.01 ， ( NH4 )2SO4 5 。1 ,
1.4.3 測漆酶的液體培養基（g/L ）。馬鈴薯200 ，麥麩20 , KH2PO4 3 , MgSO4 1.5 , VB1 0.01 ，酵母膏5 。
1.2 方法
1.2.1 分離菌種。
1.2.1.1 組織分離。組織分離是利用子實體組織來分離獲得純菌絲的方法，子實體實際上是菌絲體的扭結物，具有很強的再生能力，通過組織分離，可得純菌種，此方法簡便，取材廣泛，不易發生變異，一般新鮮的菌體都能分離成功。組織分離時，選用菌蓋肥厚、新鮮、無病蟲害的子實體。首先用70 ％的酒精棉球對菇體表麵進行消毒，然後切取一小部分組織塊，組織塊盡量是菌蓋和菌柄的交界處，其他地方如菌蓋的周圍部分、菌柄、菌柄中心都能萌發形成菌絲，但一般在菌柄與菌蓋交界處的效果最好。
分別切取蟹味菇菌柄與菌蓋處和菌蓋邊緣組織塊在無菌條件下用70 ％酒精表麵消毒1 min ，馬上移人0.1 ％升汞溶液中消毒1 一2 min ，用無菌水衝洗3 次，然後用滅過菌的剪刀將組織塊剪成2 mm大小，接人試管斜麵培養基上，置於25 ℃ 下恒溫培養，並觀察不同子實體接種部位組織分離汙染情況。
1.2.1.2 純化。選取生長相對較好的組織分離所得母種的頂端菌絲體0.5 cm2 左右接入試管斜麵，進行純化培養，每個處理重複5 次。25 ℃ 恒溫培養，定時觀察記錄純化菌絲體的萌發和生長情況。
1.2.1.3 保存。將純化後菌絲生長旺盛的斜麵放入冰箱中，於-4 ℃ 保存，備用。
1.2.2 培養方法與發酵液製備。
1.2.2.1 培養方法。250 歎三角瓶裝液體培養基50ml ，滅菌後接人13 日齡用打孔器打成的10mm菌片4 片，130r ／min , 28 ℃ 恒溫振蕩培養。
1.2.2.2 發酵液製備。在培養期間，每天取樣，4000r ／min 離心15min ，上清液即為發酵液。
1.2.3 木聚糖酶活力測定。
1.2.3.1 底物 l ％和 D N S試劑製備。木糖標準曲線製作均參照文獻[ 1 3 ] 。
1.2.3.2 活力測定。 取底物 1ml於管中， 據酶活大小加適量的粗酶液， 補加檸檬酸鈉緩衝液至2ml， 50℃水浴反應3 0 m i n ，加3 m l D N S混勻， 沸水浴 7min ， 取出冷卻後加水至2 5 ml ， 在540nm處測 OD值。以每分鍾 1m l 粗酶液與木聚糖反應產生木糖的濃度( m 1 ) 作為 1 個酶活單位。
1.2.4 漆酶活力測定。0.1mol ／L p H值為 4.6的醋酸緩衝液3.5min，加入3.36 mmol/ L 的鄰聯甲苯胺0.5 ml，再加入適當稀釋的發酵液0.5min，25 ℃ 保溫5 min , 756MC 型紫外可見分光光度計測595nm ，處光密度（OD 值），酶活力以樣品與底物反應5 min 後光密度的改變值表示。以每分鍾光密度增加0.001 為l 個酶活力單位（U ／ml）。
2 結果與分析
2.1 分離蟹味菇組織分離成功率如表l.
由表l 可知，蟹味菇較易進行組織培養，汙染率小，可通過此方法獲得優良菌株。
2.2 純化
蟹味菇子實體不同接種部位分離得到的菌絲純化後在適宜的培養條件下均在15d 長滿平板，10d 長滿斜麵，說明不同接種部位得到的菌絲基本不存在差異。菌絲體在PDA 斜麵試管上呈濃白色，邊緣為絨毛狀，氣生菌絲旺盛且爬壁能力強，成熟時色澤變灰。當培養條件不適時，生長速度減慢，菌絲可產生無性泡子。用光學顯微鏡觀察，雙核菌絲直徑為2.0 一3.0um，細胞狹長，有明顯鎖狀聯合；單核菌絲直徑為1.0 一2.0 um，細胞狹長，有分隔，少分枝，無鎖狀聯合。
2.3 蟹味菇分泌木聚糖酶曲線
蟹味菇在液體培養基中進行深層培養，結果如圖l 所示。由圖1 可見，蟹味菇在前5d 產木聚糖酶水平不變，第6 天產木聚糖酶能力迅速上升，但第7 天產酶能力迅速下降，以後漸趨於平穩。
2.4 蟹味菇對漆酶的分泌蟹味菇在液體培養基中進行深層培養，結果如圖2 。由圖2 可見，漆酶的酶活力出現負值，在10d 的測定中有5d 是負值，第3 天的酶活力是零，基本可以判定蟹味菇不分泌漆酶，或者說它的分泌量很少，不易測得，基本不具有研究價值。
3 小結
蟹味菇是木生白腐菌的一種，有較強分解木質素、纖維素、半纖維素的能力；木聚糖酶和漆酶都是研究較多，且具有重要用途的酶，所以筆者選擇他們做為研究對象。組織分離培養試驗結果表明，純化後的菌株生長力旺盛，可以為以後的科學研究保存菌株。液體發酵試驗表明，蟹味菇分泌木聚糖酶，且產木聚糖酶能力較強，具有深人研究的價值，但一定程度上不分泌漆酶。對蟹味菇分泌木聚糖酶培養條件的優化將有待於進一步研究。
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