天花病毒和痘苗病毒 (Variola virus and vaccinia virus)
〖HT5SS〗天花病毒引起傳播迅速的烈性傳染病——天花。天花曾是人類曆史上的重 大災禍 之一。 由於使用痘苗病毒疫苗預防天花，1977年天花在全世界流行終止，1980年世界衛生組織 (WHO)宣布，天花已經被消滅，不再用痘苗病毒疫苗預防天花。
[BT4] 1.形態和理化學特性 痘苗病毒粒子的浮密度在稀釋的緩衝液中為116g/cm3，在53%的蔗糖溶液中為1 25g/cm3，在酒石酸鉀溶液中為12/cm3。 重量為45×10-15g。痘苗病毒和天花病毒在生理pH值時帶有負電荷，痘苗病毒 的等電點為pH40，而天花病毒則為pH34。 痘苗病毒和天花病毒的外形和大小十分相似，大小為270×218nm左右。抗原性上也極相似 ，但二者毒力不同。
[BT4]2.抗原性 天花病毒的抗原性與痘苗病毒極為相似，病變皮膚中的抗原，可用瓊脂擴散試驗和補 體結合試驗進行檢測。機體感染這兩種病毒 1周後，可用中和試驗、補體結合試驗和血凝 抑製試驗進行各種抗體檢測，但難以相互鑒別。
[BT4]3.培養天花病毒和痘苗病毒可在雞胚絨毛尿囊膜上生長，接種2～3日後天花病毒 形成1mm 左右的光滑痘斑，痘苗病毒為中心壞死的大痘斑。這兩種病毒能在雞胚細胞和其它一些原代 細胞及傳代細胞如HeLa等細胞中增殖，在培養細胞中，以細胞至細胞方式傳播。
[BT4]4.病原性 天花病毒經上呼吸道侵入患者機體，潛伏期8～15天。在潛伏期間，病毒在淋巴樣組織中 增殖。病毒侵入機 體有後呈現如下的感染過程：①在侵入部附近的淋巴樣組織中進行第一次增殖；②一過性病 毒血症及 感染全身巨噬細胞係細胞；③在這些細胞中進行第二次增殖；④第二次病毒血症；⑤出現臨 床症狀。 患者病初體溫升高，並有頭痛和四肢疼痛以及惡心、嘔吐等症狀， 在發病第3～4天 開始出疹。先是斑疹、丘疹、皰狀疹。1～4天後形成水泡，此後2～6日發展成膿皰，此時往 往由於機體吸收了壞死組織成分(並非細菌繼發感染)，而第二次發熱。病人在出現皮疹的 同時 ，口腔、上呼吸道及食管上部粘膜也發生很多粘膜疹性小潰瘍，其中含有大量天花病毒， 並通過飛沫傳給易感者，這是天花病人排出病毒的主要方式。 皮膚上的膿皰逐漸幹縮結痂，從病程的開始到結痂脫落 ，需2～4周。結痂脫落後 留下紅色瘢痕，但瘢痕顏色隨後漸漸消退。升高的體溫常常在發 疹 後24小時內下降。病變多發生在麵部，軀幹部很少發生。天花在流行病學上分重型和輕型兩 種，重型死亡率高達15%～30%，輕型死亡率低於1%。天花病毒隻感染人、猴和兔。天 花病 毒除引起人類的嚴重感染外，以劃痕接種猴子，可引起典型皮疹。接種家兔皮內，引起明顯 的 局部病變，以劃痕法接種眼角膜，角膜上出現透明小圓皰，隨後因中 心部上皮脫落而形成凹陷。 痘苗病毒的宿主範圍較廣，它能引起人、牛、水牛、豬、猴、駱駝、象、綿羊、家兔及鼠 類的感染。痘苗病毒疫苗株成功地用於天花的預防，但疫苗株痘苗病毒仍有一些缺陷和不足 。如常發生種 痘後疹，以及種痘後紫癜、壞疽痘，最大的問題在於1/100萬的種痘後腦炎(一過性腦炎 ) 和免疫缺陷患者的全身性發痘。 多年來的體外研究表明，痘苗病毒基因組中約1/3的基因，並非自身複製所必需，但體 內感染證明，某些非必需區是體內增殖必需的。對於痘苗病毒致病基因的研究表明，痘苗 病毒具有巧妙的生活方式，它有逃避機體免疫攻擊的機製。痘苗病毒合成的35 kDa分泌蛋白與C4b結合，抑製經典的補體激活途徑。痘苗病毒具有一定的抵抗幹擾素的 作 用。另外，痘苗病毒還產生一種絲氨酸蛋白酶抑製劑，抑製痘苗病毒表達 的外源蛋白與抗體之間發生反應。痘苗病毒基因組中還存在著與腫瘤壞死因子、白介素1和 白介素6受體相對應的ORF，推測其產物可能與這些細胞因子受體結合。 痘苗病毒TK基因和HA基因也屬致病基因。Paoletti等(1992)將痘苗病毒的TK、HA、ATI等1 8個基因進行定向缺失，得到缺失變異株NYVAC，將其接種小鼠腦內，計算小鼠50%致死量 ，發現這種變異株比原始株的毒力弱1萬倍。另外NYVAC株隻在雞胚細胞中增殖，卻不能在 人源細胞株中增殖。
〖BT4〗5.免疫 天花痊愈後具有堅強的免疫力，可以持續終身，很少第二次患天花。 接種痘苗病毒後11～13天，可查到中和抗體、補體結合抗體和血凝抑製抗體，但抗體滴度很 低，持續時間較短。複種後7天，中和抗體滴度明顯增高。 一次成功的痘苗病毒接種完全免疫持續時間為2年，長者可達5～7年或更久，此時雖可能發 生天花，但症狀輕，病程短，死亡率低。
〖BT4〗6.診斷 利用電子顯微鏡負染技術，可以直接進行快速診斷。即將丘疹和水皰期的病變部組織 接種雞胚絨毛尿囊膜可鑒定病毒 。天花病毒為小痘斑，痘苗病毒為中心壞 死的大痘斑，牛痘和猴痘為出血性痘斑。天花病毒在雞胚內生長溫度的上界為385℃，而 痘苗病 毒溫度上界為41℃。天花病毒不能在雞胚成纖維細胞上形成蝕斑，而痘苗病毒則可形成蝕斑 。瓊脂擴散試驗、補體結合試驗可檢測抗原，中和試驗、補體結合試驗和紅細胞凝集抑製試 驗則可檢測抗體。病毒DNA酶切圖譜分析和病毒細胞感染肽圖分析也有鑒別診斷意義。
〖BT4〗7.痘苗病毒的起源 關於痘苗病毒的起源，學者們的意見不一致。有謂痘苗病毒是天花病毒連續通過兔體和犢牛 後形成的變異株，也有人認為痘苗病毒起源於牛痘病毒。有人甚至認為，Jenner的原始牛 痘毒株已被天花病毒汙染，因此，痘苗病毒實際上是這兩種病毒的重組型。
〖BT4〗8.痘苗病毒的應用 1982年，Paoletti和Moss研究組將外源基因插入痘苗病毒的TK基因中，首次成功地構建了在 哺乳動物細胞中表達外源基因的重組痘苗病毒。10多年來，應用重組痘苗病毒成功地表達了 來源於植物、動物乃至人類的數十種基因。重組痘苗病毒具有如下特點： ①重組痘苗病毒仍然保留野生型痘苗病毒的特性，感染幾乎所有源於哺乳動物的培養細胞 ，並表達外源蛋白； ②被表達的外源蛋白，在感染細胞中，能忠實地進行修飾； ③與其它病毒表達載體相比，具有較高的表達效率；④通過對動物接種重組痘苗病毒的方 法，能了解外源蛋白對個體的作用以及機體的免疫應答； ⑤表達抗原基因的重組痘苗病毒。可作為基因重組疫苗。 正因為有上述特點，痘苗病毒載體廣泛用於分子生物學、細胞生物學、免疫學領域以及新型 疫苗的開發。
[BT4](1)基因組結構與複製 痘苗病毒基因組為兩端交叉閉鎖的線型雙鏈DNA分子，根據毒株的不同，其長度變化在180k b～200kb之間，編碼約200種蛋白質。基因組的兩端向內，並有10kb的倒置重複序列，即序 列完全一致，方向相反，呈現倒置互補，其中含70bp～125bp的重複區。此70bp為痘苗病毒 的複 製所必需，其中20bp(ATTTAGTGTCTAGAAAAAAT)尤為重要。此末端倒置重複序列變異較大，即 使同一毒株其結構亦不盡相同。這種兩端變異較大的序列，大多編碼非必需蛋白質，但與病 毒毒力及宿主範圍有關。 在痘苗病毒基因組中央區域約有120kb的保守區，核苷酸變異較小，變異率在10%左右。晚 期基因大多集中於此區，主要編碼結構蛋白。痘苗病毒基因組含約198個主要ORF和65個 與其它基因重疊的小ORF，總共約含可編碼263種左右蛋白質的潛在基因。痘苗病毒的閱讀 碼框架 間相距僅幾個至幾十個堿基，有的閱讀框架相互重疊。基因組中無內含子，無基因編接機製 。 痘苗病毒增殖均在哺乳動物細胞漿中進行，並在20小時內完成一個病毒複製周期。過去 有人曾分離過無胸 苷激酶活 性(TK-)和無血凝作用(HA-)的痘苗病毒變異株。因此，目前為止人們常在TK基因或HA基 因中 插入外源基因進行表達。痘苗病毒基因組左側20～30kb不穩定，在單純的反複傳代過程中 亦會發生某些基因的丟失。因此，也有人認為此區域為非必需基因群。
[BT4](2)重組痘苗病毒的製備 Paoletti等首次利用標記拯救技術，製備了插入有外源基因的重組痘苗病毒。製備重組病毒 時，首先準備含有痘苗病毒非必需區基因的質粒，在此非必需區中部插入痘苗病毒自身的啟 動子(成為痘苗病毒表達載體)，啟動子下遊連接欲表達的外源基因。接著對已感染痘苗病毒 1～2小時的細胞，轉化上述重組質粒，使重組質粒中所含的痘苗病毒非必需區序列與痘苗病 毒非必需區序列發生同源重組。外源基因在這一過程中重組到痘苗病毒基因組中，形成重組 痘苗病毒粒子。 應用磷酸鈣法進行體內重組，得到的重組病毒隻占全部子代病毒的01%左右，脂質體法可 使重組率提高到03%～05%，而電激法又可提高重組率10倍以上。為了提高重組率，將重 組質粒DNA與純化的痘苗病毒DNA 混合，共同轉化已感染痘苗病毒的細胞，可得到1/3的重組病毒。如果將重組質粒NotI酶切 片 段與痘苗病毒DNA的NotI酶切片段進行連接，進行體內重組，則可得到1/4的重組病毒。 最常用胸苷激酶(TK)基因區作為外源基因插入痘苗病毒的非必需區，隻需5’溴脫氧尿 苷(BUdR)加壓即 可得到TK重組病毒。也常用血凝素基因(HA)作為插入外源基因的非必需區，此時用雞 紅細胞篩選HA重組病毒，但由於痘苗病毒的自然突變，存在著TK-和HA-變異株，因此表 達 外源基因時應再增加篩選標誌。例如利用β半乳糖苷酶基因、新黴素抗性基因(Neo)、 鳥嘌呤 磷酸核糖轉移酶基因(gpt)等，可在培養液中加入Xgal、G418、黴酚酸等試劑，以便篩 選出重組病毒。
[BT4](3)疫苗製備 痘苗病毒載體已廣泛用於外源基因的表達調控研究，逐步成為常規表達外源蛋白的工具 。利用痘苗病毒載體進行疫苗開發研究主要有如下兩個大的方麵。 首先，利用痘苗病毒表達外源基因生產多肽或亞單位疫苗。由於疫苗病毒表達的外源蛋白， 比細菌、酵母及多角體病毒表達係統更接近天然結構，病毒穩定性好，增殖滴度高，宿主範 圍廣，便於操作，且價廉容易生產。因此，如何構建和利用高效表達痘苗病毒載體係統成 為表達外源基因的關鍵一步。 其次，利用痘苗病毒載體進行重組活疫苗的研究。由於重組痘苗病毒不僅誘導機體產生體液 免疫，而且誘導堅強的細胞免疫。痘苗病毒作為基因重組活疫苗載體，不需佐劑即 可 免疫動物，病毒在體內增殖過程中產生的外源蛋白可剌激機體產生免疫反應。表達的外源蛋 白在細胞內被修飾後，與自身的組織相容性複合體(MHC)結合，剌激CD+8T淋巴細胞( 細胞毒性T淋巴細胞)。 重組痘苗病毒已用於人類疾病的臨床研究，有些重組痘苗病毒活疫苗已處於免疫觀察階段。 在北歐，從1989年起野外投放狂犬痘苗重組病毒3次，到了1990年後半葉投放區野生狐狸 及 其周圍家畜，已無狂犬病發生。猴免疫缺陷病毒(SIV)痘苗重組病毒接種猴體後可抵抗強毒 的攻擊。HIV1痘苗重組病毒接種人體，亦已進入臨床試驗階段。 痘苗病毒在基因重組活疫苗研究中的優點之一，是可進行多價基因重組疫苗的製備。由於痘 苗病毒的基因組容量大，可插入25Kb的外源基因而不影響自身複製。因此，可將不同的外源 基因，特別是各種病毒保護性抗原基因一同插入痘苗病毒基因進行表達。這種嚐試已有成功 的報道。 總之，痘苗病毒無致癌性，穩定性好，宿主範圍廣，基因組容量大，非必需區多，能誘發機 體產生堅強的體液免疫和細胞免疫等都是其突出的優點。雖然存在百萬分之一的種痘後腦炎 和全身性發痘，但 隨著對其基因組結構、功能的深入研究和改造，必將成為分子生物學、基因工程生物活性物 質生產、基因重組疫苗及多價疫苗研究的有效工具。
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