豬瘟病毒診斷
為了消滅豬瘟，需要快速而確實的診斷技術。流行病學、症狀學和病理解剖學等方 麵的資料，具有重要的參考價值，但確診必須采取病料，進行病毒的分離鑒定或作抗體 測定。 疫情調查時，除需注意流行情況,還應了解是否已經進行免疫接種， 所用疫苗有無 殘餘毒力?非典型豬瘟在成年豬中大多表現為輕症疾病，或者完全沒有症狀， 而隻仔豬 和乳豬則發病。但是初生仔豬沒有特征性的病理變化，難以根據病變特征進行診斷。 近二十多年來，世界各國對豬瘟的實驗診斷進行了大量研究，現將已被實際采用的 幾種方法介紹如下：
(1) 動物接種：檢測豬瘟病毒的最敏感方法，就是應用易感的幼齡豬( 20～40斤體 重)進行接種試驗。取病豬或新鮮豬屍的血液或組織乳劑肌肉接種1～2頭幼豬。 試驗幼 豬應事先進行中和試驗，排除豬瘟和病毒性腹瀉粘膜病的感染。如果幼豬在接種後6～ 7天停食或體溫升高，則即采血分離病毒。幼豬發病死亡後，立即采取扁桃體、 脾髒和 頷下淋巴結作病毒分離。如果幼豬在接種後21天不發病或者發病後恢複，則采血測定血 清的中和效價，並用強毒進行攻毒試驗。由血液或組織中分離獲得豬瘟病毒，或者被接 種幼豬產生中和抗體，對強毒攻擊呈現免疫性，即可判為陽性。相反，幼豬不發病，不 產生中和抗體，則應考慮其它病原體的可能性。由於普遍存在低毒力的豬瘟病毒株，所 以即使被接種幼豬不呈現典型豬瘟症狀，也應進行血液中的病毒分離試驗。 也可應用抗豬瘟高免血清進行接種保護試驗。將待檢病料皮下注射2頭幼豬，其中1 頭注射高免血清(每公斤體重1ml)，如果被檢病料中含有豬瘟病毒， 則未注射血清的 幼豬發病，而被動保護的幼豬不發病。如果未注射血清的幼豬也不發病，則在接種後21 天將這二頭幼豬同時接種強毒進行攻擊。 如果待檢病料中含有致病性細菌，則注射高免血清和未注射高免血清的幼豬都將發 病。當然，如果抗豬瘟高免血清中同時含有抗菌抗體，則就易於發生誤診。 增加試驗豬數，當然可以提高試驗的精確性。但是必須相應增加隔離設施，工作量和費 用當然也將增多。 中國獸藥監察所建立了一個應用家兔代替豬診斷豬瘟的方法。 他們試用8株豬瘟病 毒感染家兔，一周後用豬瘟兔化弱毒(C係)攻擊，結果7株病毒可以產生免疫力，在以兔 化弱毒攻擊後不發生熱反應。而感染出血性敗血症、豬丹毒或炭疽的耐過兔，則在兔化 弱毒攻擊時，發生熱反應。診斷臨床病料時，可采病豬的脾髒或淋巴結和腎髒的混合乳 劑或血液，經耳靜脈接種家兔，每天測溫3～4次，一周後， 再經耳靜脈接種10-2C係 兔化弱毒或其100個50%兔發熱劑量(DH50)。同樣每天測溫，並根據體溫反應判定結果 。 表22-1 診斷豬瘟的兔接種試驗(舉例) 熱 反 應 結 果 判 定第1次注射第2次注射第1 次注射結果存在的病毒－－獲得免疫(無熱反應) 強 毒－＋未免疫(無熱反應) 沒有病毒＋－獲得免疫(有熱反應 )兔化毒＋*＋未免疫(有熱反應) 沒有病毒 *係非特異性熱反應，可能是接種材料細菌性汙染的緣故。熱反應是指家兔在接種後，體溫上升，超過常溫1℃以上(或超過405 ℃以上)。 被檢材料中含有豬瘟病毒時，第1次注射後出現熱反應，證明是兔化弱毒。 但也可 能不出現熱反應，且在第2次接種兔化弱毒時也不出現熱反應， 則證明被檢材料中含有 強毒，因野外強毒尚未適應兔體，不引起熱反應，但使家兔產生免疫力， 故在第2次接 種兔化弱毒時，也不發生熱反應。本法優點是能檢出被檢材料中可能存在的強毒病毒和 兔化弱毒株，且能予以鑒別，但需8天才能獲得結果。
(2) 瓊脂擴散試驗：雖可選用病豬的脾、淋巴結和回腸小段作為抗原，但以胰腺最好 。另需具備特異性好的豬瘟高免血清。本法操作簡單，但敏感性較低，肯定是豬瘟的病例 的陽性率也低於50%。歐洲一些國家， 如英國的某些診斷實驗室專門製備高價免疫血清 和抗原，並有統一的判定標準。 用pH86的巴比妥緩衝液配製12%瓊脂，內加1/萬柳硫汞防腐。按中央1孔、 周圍6 孔的模式打孔。孔徑5mm，孔間距6mm。檢測抗原時，將高免血清滴入中央孔內，周圍孔 內分別滴加標準抗原和待檢病料乳劑。檢測抗體時，將標準抗原滴入中央孔內，周 圍孔上、下兩孔內滴加高免血清，其它4孔分別滴加被檢血清。
(3) 免疫熒光試驗：主要用於檢測病毒抗原，但也可以檢測抗體。 應用熒光抗體，可在宿主器官的抹片或冰凍切片中發現病毒抗原，也可先將可疑病 料乳劑接種細胞培養物(最常應用PK15細胞係)，隨後再用熒光抗體檢出感染細胞。 直 接檢查病料時，采取扁桃體、脾、淋巴結和胰腺製備冰凍切片或抹片，應用直接或間接 法熒光抗體進行檢測。日本Sawada設計了一個從活豬采取扁桃體標本的器械，成功地 在扁桃體隱窩抹片中找到上皮細胞內的豬瘟病毒抗原。從檢測結果來看，發病早期扁 桃體的檢出率較高；而於感染後期，胰腺中的病毒抗原檢出率高於其它髒器。強毒病 毒抗原的熒光明顯，且可見於許多上皮細胞和淋巴細胞的胞漿內。弱毒病毒抗原通常隻 能見於扁桃體隱窩上皮的胞漿內，熒光呈斑點狀， 例如接種C株兔化弱毒疫苗的豬僅能 在注苗一周左右在扁桃體中找到弱的熒光斑。 如上述，檢測病毒抗原的另一個方法是將被檢材料接種PK15細胞係， 隨後用熒光 抗體染色。感染細胞呈局限性集團，形成熒光斑點。計數斑點，可以粗略滴定被檢材料 中的病毒含量。Mengeling建議在接種被檢材料並吸附後， 加入含有抗血清 的營養液進行培養。加入抗血清的目的是防止病毒從細胞釋放出來，構成第二次感染。 必須指出，牛腹瀉粘膜病病毒與豬瘟病毒的抗原性一致，也能結合豬瘟抗體。 但 因BVDMD病毒對豬並無明顯病原性，也不能在豬體內充分增殖，因此不致幹擾診斷結果。 且因BVDMD病毒可在細胞培養物上引起細胞病變，鑒定並不困難。 免疫熒學技術的關鍵因素，是用高效價的特異性免疫血清，提取IgG， 進行熒光素 標記。染色時將熒光抗體作盡可能高的稀釋，以便消除非特異性染色，並且設置多種對 照，包括已知的陰、陽性標本以及熒光抑製試驗等等，請參閱本書第十四章。
(4) 血清中和試驗：由可疑髒器分離病毒，結果常不滿意，特別是在非典型和慢性病 例，因為其中病毒含量甚少，且因經常同時存在抗體，病毒有被抗體中和的危險。血清 中和試驗可以測出動物體內的抗體，但因推廣應用弱毒疫苗，豬群中的豬瘟抗體滴度普 遍較高，故應進行雙份血清的檢查(前後相差14天以上)，才能確立抗體滴度增高與現症 的關係。 由於非典型豬瘟病例對血清學變種331株病毒的陽性反應頻率增加， 故在應用血清 中和抗體試驗診斷豬瘟時，需要應用331毒株和標準毒株同時進行檢驗。 目前最常應用的血清中和試驗方法是免疫熒光中和試驗——定量病毒加不同稀釋度 的被檢血清。同時以SPF豬血清作為陰性對照，以高免血清作為陽性對照。 所有血清均經56 ℃ 30分鍾滅活。然後按下列步驟進行中和試驗。 應用內含05%乳白蛋白水解物和25mmol/L的MgCl2 6H2O(即每1 000ml中含507g) 的Earle液稀釋病毒和被檢血清。被檢血清按4×連續稀釋，由1∶4至1∶1 024。取不同稀 釋度的血清分別和等量病毒液混合，置37℃感作1小時，隨後接種飛片上的PK15細胞培 養物。同時設置各種對照組。再培養18～24小時，取出後作免疫熒光抗體檢查。計數各 飛片中熒光細胞灶的數目。與對照組比較，凡能減少90% 熒光細胞灶的血清稀釋度就是 該血清的終點滴度。1∶4血清組的熒光細胞灶減少不到90%者，判為陰性。 也可應用Gillespie的“PAV1毒株”，因其可以產生細胞病變，並被特異免疫血 清所中和。血清處理方法相同。將PAV1株病毒稀釋成每05ml含100TCID50， 隨後加 入等量稀釋血清，混合後置室溫感作90分鍾，接種細胞管，37℃培養3～4天後讀數。同時 設置不加血清的病毒對照組。按不同稀釋度血清抑製病毒產生細胞病變的管數，計算被檢 血清的中和效價。
(5) 新城疫病毒強化法：在一定條件下，先被豬瘟病毒感染的豬睾丸細胞，在隨後再 感染新城疫病毒時，可以產生細胞病變。這一現象被用來檢測豬瘟病毒，稱為新城疫病 毒強化法，簡稱END(Exaltation of NDV)。直接法END(將被檢病料直接接種細胞培養物) 的敏感性較低，但如改用兩步法，亦即先將被檢材料接種豬脾細胞培養物，傳代適應之 後再作END試驗，則可明顯提高其敏感性，幾乎能與易感豬接種法相等。 具體方法是在 豬睾丸細胞培養物中接種被檢材料(豬瘟病毒)，37℃培養4天，隨後接種106個蝕斑形成 單位的新城疫病毒，繼續培養3天。根據是否出現細胞病變進行判定。同時設對照組。 如果細胞培養物出現病變，即表示有豬瘟病毒存在。 楊興業等成功地應用END法於豬瘟血毒毒價的測定。 END法適於檢測那些易在豬源細胞中生長的野外毒株，對大部分兔化弱毒株無效， 因其往往不能在豬睾丸細胞內充分增殖。
(6)免疫酶測定技術或酶標記抗體診斷法：Saunder等報告並肯定 了應用快速酶標記抗體微量技術檢查豬瘟抗體的診斷方法。 先用PK15細胞增殖豬瘟病 毒作為抗原，包被微量滴定板，隨後加入被檢血清(第一抗體)，衝洗後再加酶標記的兔 抗豬γ球蛋白，再經衝洗，最後加入底物顯色。Saunder通過640份血清檢驗結果， 證明酶標記抗體法和血清中和試驗的符合率在99%以上。 但中和試驗需要18小時才能獲 得結果，酶標記抗體僅需1～2小時。 必須指出，Saunder等的上述結果是用酶標記抗體按間接法檢測豬瘟抗體。 由於 我國普遍開展兔化弱毒疫苗的預防注射，豬血清中幾乎都有豬瘟抗體，給酶標抗體診斷 法帶來困難。 丘惠深等分別應用淋巴細胞雜交瘤技術，研製出可以鑒 別豬瘟兔化弱毒、 豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒及邊界病病毒的特異性豬瘟兔化弱毒單抗及豬瘟石門株單抗。 用親和層析法製成單抗酶聯試劑後，可將疫苗注射血清、強毒感染血清、混合血清和 豬瘟陰性血清區別開來。房德興等建立了單克隆抗體ELISA抑製法，用於檢測細胞培養物中的豬瘟兔化弱毒 ，可望取代兔體接毒試驗檢測疫苗效價。 我國謝昕等人設計用酶標記抗體直接檢測病豬組織和白細胞中的病毒抗原， 獲得初步成功。該氏等通過10頭實驗感染豬和10頭非豬瘟豬的白細胞和不同髒器的檢查， 證明檢出率和特異性都較高，而且實驗豬即使接種過疫苗，幹擾也不明顯。人工感染石 門係強毒24小時後，即可從病豬外周血液的白細胞中檢出病毒抗原。而10頭非豬瘟豬的 白細胞全呈陰性結果。為排除非特異性反應，酶抗體結合物在純化後， 還需用非免疫 健康豬的組織粉(肝粉或脾粉等)和紅細胞進行吸收。檢測試驗中則應注意消除組織細胞 中自身含有的過氧化物酶，即內源性酶。謝昕等應用內含001%過氧化氫的001%疊氮化 鈉溶液抑製內源性酶，取得較好效果。 從脾、肝和扁桃體等髒器的檢出率來看，脾髒和肝髒的檢出率高，扁桃體的檢出率 較低。感染豬瘟的腎髒皮質部細胞被染成黃棕色，尤其在腎小球囊周圍最為明顯，說 明豬瘟病毒在腎的皮質部增殖。扁桃體的檢出率低(6/10)，可能與瀕死期采集標本有關， 因扁桃體此時大多已經化膿壞死。 Wensvoorf等和Edwards等各自研製成功分別對HCV、瘟病毒屬其它病毒、 整個瘟病毒屬特異的單克隆抗體， 結合酶聯免疫吸附試驗可以準確診斷HCV在豬體的 感染並與感染其它兩種反芻動物的瘟病毒區分開來。 Shannen等用抗原捕獲ELISA檢測感染HCV的血液和組織樣品， 能在感染豬即將顯示豬 瘟症狀時，快速、敏感地予以檢出。
(7)RTPCR法：Liu等報道了用RTPCR快速檢測感染組織中的HCV。 從感染HCV的組 織中提取總RNA，以此總RNA為模板,進行反轉錄合成第一鏈cDNA，然後在兩個 HCV特異引物存在的情況下用TaqDNA聚合酶進行擴增，合成HCV特異的雙鏈cDNA。擴增的 DNA片段用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。該方法的敏感性可達104TCID50的HCV。 當用 巢式 引物擴增時，敏感性可提高1 000倍。 該方法可能對HCV的病原學和流行病學研究很有用 途。
(8)髓細胞檢查法(Medullogram Test)： 這是1975年由羅馬尼亞Manolescu提出的 方法，據雲可對急性豬瘟強毒感染進行鑒別。 在發病初期，采取病豬胸骨的髓漿，製成抹片，姬姆薩染色後作形態學檢查。如出 現副淋巴母細胞型單形態細胞(Paralymphoblasts type monomorphous cells)的增生， 則是強毒豬瘟的特征，豬感染C株兔化弱毒疫苗時不產生這種細胞。 檢查髓細胞的優點是不需要細胞培養物。在農村條件下，殺1～2頭臨床病豬，采取 骨髓漿汁抹片(胸骨頭或肋軟骨部分)，兩小時就可得出結果。歐洲有些國家已經推廣應 用。 此外，某些學者應用免疫電泳法(Immunoelectroosmophoresis,IEOP) 和改良補體結 合試驗於豬瘟診斷，也已獲得有希望的結果。
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