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粘膜病病毒診斷



錄入時間:2009-7-8 13:42:14 來源:青島betway必威西汉姆联

粘膜病病毒診斷
(1)    檢測病毒和病毒抗原:  
 ① 病毒分離:急性粘膜病具有持續的病毒血症,所以血液是最好的病毒分離材料。 采取凝固血塊,經凍融幾次後作為接種物。屍體剖檢時則采取腸係膜淋巴結或脾髒,也 可應用骨髓。  檢查局部感染時,可用棉拭子采取局部的分泌物或排泄物,置入含有高濃度抗生素 的運輸液中(每ml 5 000 u的青、鏈黴素和10μg的兩性黴素B)。  不能及時接種的病料,應冰凍保存,以免降低或喪失感染性。  各種牛源細胞均可用於病毒分離,包括牛腎和胎牛肺原代細胞或繼代細胞以及犢牛 睾丸細胞。犢牛原代睾丸細胞常可顯示較好的細胞病變。  犢牛原代睾丸細胞應用加有酵母浸膏和10%犢牛血清的乳白蛋白水解物作為生長液。 長成單層後,應用加有2%犢牛血清的199液作為維持液。其它細胞的培養液相同。 必須 注意,所用的血清應該不含BVDMD病毒抗體。  某些毒株在合適條件下產生細胞病變,使用上述犢牛原代睾丸細胞和生長液,偏堿 的pH以及轉管培養方法,有利於細胞病變的出現。不同毒株產生的細胞病變不盡相同, 某些毒株在連續傳代以後才出現細胞病變。    BVDMD病毒不形成包涵體。  分離株如果引起細胞病變,則應進一步用抗BVDMD病毒的免疫血清進行中和試驗鑒 定之。不論各毒株之間的抗原性差異如何,如果BVDMD特異血清對新分離毒株的中和效 價≥100,即可證明是BVDMD病毒。  由於無致細胞病變作用的BVDMD病毒株常能幹擾另一株有致細胞病變作用的毒株產 生細胞病變,因此可以應用蝕斑減數試驗證明這類毒株的存在。
② 動物接種:選用未感染過BVDMD的6月齡健康犢牛,隔離觀察半個月,確證無病後,每頭 犢牛 接種待檢血液或病料乳劑(按常規要求處理)50ml,其中40ml作靜脈注射,10ml作滴鼻接種。  此 後每天進行臨床觀察和體溫測量,並定期采血作病毒分離和血清抗體檢測。
③ 瓊脂擴散試 驗:存在於病畜腸粘膜、腸係膜淋巴結、胰腺以及發 生病變的其 它組織中的沉澱抗原,可用瓊脂擴散試驗檢出。方法是選取發炎或糜爛和潰瘍周圍的粘膜, 不經任何處理,直接與陽性血清進行瓊脂擴散試驗。據統計,約有60% 的病牛呈現陽性 反應。
④ 電鏡檢查:獲得的新鮮病料或細胞培養 物可直接用負染法,在電鏡下觀察病毒粒子的特征。也可用鉻投影的電子顯微照相測量 病毒的 大小和形態。病毒粒子呈球形,直徑35~55nm,有囊膜(無突起)和一個直徑約24~30nm的病 毒核心。也可製作超薄切片標本後檢查,病毒粒子存在於胞漿、空泡和擴張的內質網池內,形 態比較規整,常有囊膜,大小約60nm。
⑤ 免疫熒光染色:BVDMD病毒的特異性免疫血清以往用山羊或牛製備。後來發現, 用 豬 製備的抗血清在用熒光素標記後較少出現非特異性熒光。經鼻道給豬感染BVDMD病 毒,經1個月後用豬瘟強毒攻擊。在攻毒後14~21天分離血清,56℃滅活半小時後提取I gG,-20℃保存備用。  有關IgG提取以及熒光素的標記方法,請參閱本書第十四章。  應用熒光抗體技術(通常用直接法)可以檢測感染細胞培養物(飛片)以及病變組織冰 凍切片中的病毒抗原。熒光顆粒出現於胞漿中,並可應用未標記抗體進行熒光抑製試驗 作進一步鑒定。
⑥ 雙抗體夾心ELISA:王新平等建立了雙抗體夾心ELISA檢測BVDV,給本病的診斷、檢 疫提供了一種簡便、有效的手段。
⑦ 核酸探針雜交試驗:是直接檢測血細胞和髒器組織中BVDV高度特異和靈敏的 方法並在臨床上得到初步應用。
⑧反轉錄多聚酶鏈式反應(RTPCR):根據BVDV病毒基因組序列合成一對或數對引物,應 用 RTPCR 可以高度特異、靈敏地檢測器官、組織、培養細胞中的BVDV,並區分不同的BVDV 株或與豬瘟病毒、邊界病毒相區別。  牛在妊娠前3個月感染非致細胞病變型BVDV,可引起流產、 死胎或先天性感染以及 生產免疫耐受性的犢牛。先天性感染的牛一般外觀健康,但一旦感染致細胞病變型BVDV,則 常常死於粘膜病。畜群中先天性感染牛所占百分比一般較小,但卻足以起到傳播作用, 使整個牛群長期帶毒。因此檢出和清除這些感染牛是很重要的。目前常用的BVDV 分離和抗原檢測技術,如免疫熒光試驗和細胞培養方法等耗時,繁瑣,不能快速得出診斷結 果。RTP CR可以快速敏感地檢出BVDV,與核酸探針結合起來,更可將靈敏度提高到一個新水平。

 

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