粘膜病病毒診斷
(1) 檢測病毒和病毒抗原：
① 病毒分離：急性粘膜病具有持續的病毒血症，所以血液是最好的病毒分離材料。 采取凝固血塊，經凍融幾次後作為接種物。屍體剖檢時則采取腸係膜淋巴結或脾髒，也 可應用骨髓。 檢查局部感染時，可用棉拭子采取局部的分泌物或排泄物，置入含有高濃度抗生素 的運輸液中(每ml 5 000 u的青、鏈黴素和10μg的兩性黴素B)。 不能及時接種的病料，應冰凍保存，以免降低或喪失感染性。 各種牛源細胞均可用於病毒分離，包括牛腎和胎牛肺原代細胞或繼代細胞以及犢牛 睾丸細胞。犢牛原代睾丸細胞常可顯示較好的細胞病變。 犢牛原代睾丸細胞應用加有酵母浸膏和10%犢牛血清的乳白蛋白水解物作為生長液。 長成單層後，應用加有2%犢牛血清的199液作為維持液。其它細胞的培養液相同。 必須 注意，所用的血清應該不含BVDMD病毒抗體。 某些毒株在合適條件下產生細胞病變，使用上述犢牛原代睾丸細胞和生長液，偏堿 的pH以及轉管培養方法，有利於細胞病變的出現。不同毒株產生的細胞病變不盡相同， 某些毒株在連續傳代以後才出現細胞病變。 BVDMD病毒不形成包涵體。 分離株如果引起細胞病變，則應進一步用抗BVDMD病毒的免疫血清進行中和試驗鑒 定之。不論各毒株之間的抗原性差異如何，如果BVDMD特異血清對新分離毒株的中和效 價≥100，即可證明是BVDMD病毒。 由於無致細胞病變作用的BVDMD病毒株常能幹擾另一株有致細胞病變作用的毒株產 生細胞病變，因此可以應用蝕斑減數試驗證明這類毒株的存在。
② 動物接種：選用未感染過BVDMD的6月齡健康犢牛,隔離觀察半個月,確證無病後,每頭 犢牛 接種待檢血液或病料乳劑(按常規要求處理)50ml,其中40ml作靜脈注射,10ml作滴鼻接種。 此 後每天進行臨床觀察和體溫測量,並定期采血作病毒分離和血清抗體檢測。
③ 瓊脂擴散試 驗：存在於病畜腸粘膜、腸係膜淋巴結、胰腺以及發 生病變的其 它組織中的沉澱抗原，可用瓊脂擴散試驗檢出。方法是選取發炎或糜爛和潰瘍周圍的粘膜， 不經任何處理，直接與陽性血清進行瓊脂擴散試驗。據統計，約有60% 的病牛呈現陽性 反應。
④ 電鏡檢查：獲得的新鮮病料或細胞培養 物可直接用負染法，在電鏡下觀察病毒粒子的特征。也可用鉻投影的電子顯微照相測量 病毒的 大小和形態。病毒粒子呈球形，直徑35～55nm，有囊膜(無突起)和一個直徑約24～30nm的病 毒核心。也可製作超薄切片標本後檢查,病毒粒子存在於胞漿、空泡和擴張的內質網池內,形 態比較規整,常有囊膜，大小約60nm。
⑤ 免疫熒光染色：BVDMD病毒的特異性免疫血清以往用山羊或牛製備。後來發現， 用 豬 製備的抗血清在用熒光素標記後較少出現非特異性熒光。經鼻道給豬感染BVDMD病 毒，經1個月後用豬瘟強毒攻擊。在攻毒後14～21天分離血清，56℃滅活半小時後提取I gG，-20℃保存備用。 有關IgG提取以及熒光素的標記方法，請參閱本書第十四章。 應用熒光抗體技術(通常用直接法)可以檢測感染細胞培養物(飛片)以及病變組織冰 凍切片中的病毒抗原。熒光顆粒出現於胞漿中，並可應用未標記抗體進行熒光抑製試驗 作進一步鑒定。
⑥ 雙抗體夾心ELISA：王新平等建立了雙抗體夾心ELISA檢測BVDV,給本病的診斷、檢 疫提供了一種簡便、有效的手段。
⑦ 核酸探針雜交試驗：是直接檢測血細胞和髒器組織中BVDV高度特異和靈敏的 方法並在臨床上得到初步應用。
⑧反轉錄多聚酶鏈式反應(RTPCR)：根據BVDV病毒基因組序列合成一對或數對引物，應 用 RTPCR 可以高度特異、靈敏地檢測器官、組織、培養細胞中的BVDV，並區分不同的BVDV 株或與豬瘟病毒、邊界病毒相區別。 牛在妊娠前3個月感染非致細胞病變型BVDV,可引起流產、 死胎或先天性感染以及 生產免疫耐受性的犢牛。先天性感染的牛一般外觀健康，但一旦感染致細胞病變型BVDV,則 常常死於粘膜病。畜群中先天性感染牛所占百分比一般較小，但卻足以起到傳播作用， 使整個牛群長期帶毒。因此檢出和清除這些感染牛是很重要的。目前常用的BVDV 分離和抗原檢測技術,如免疫熒光試驗和細胞培養方法等耗時，繁瑣，不能快速得出診斷結 果。RTP CR可以快速敏感地檢出BVDV，與核酸探針結合起來，更可將靈敏度提高到一個新水平。
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