診斷雖然東方型馬腦炎和西方型馬腦炎的臨床症狀相當特征，組織病理學上也有典型的病毒性腦炎變化，可提供一定的診斷依據,但是最後確診必須靠病毒的分離、鑒定以及特異性血清學診斷。
(1)病毒的分離:分離病毒的材料包括馬和其它發病動物的腦以及媒介昆蟲組織,這些材料必須新鮮。由於在動物死後，病毒迅速消失，特別是在溫暖季節，因此最為理想的方法是撲殺一個瀕死期患畜，立即取出腦組織(大腦皮層和海馬角各一塊)，迅速冷藏，並盡快送至實驗室。必要時可切取幾塊1cm3大小的上述腦組織，浸泡於50%中性甘油鹽水中。實驗室在收到標本後，立即加入05%的水解乳蛋白的Hanks液和青、鏈黴素，用勻漿機製成10%乳劑，離心沉澱後，取上清液作動物接種用。動物病毒血症期間(此時剛剛開始出現或者還未出現症狀，但體溫已經上升)的全血和血清中含有病毒，可作病毒分離之用。但因病毒血症出現在疾病早期，而且持續時間不長，因此必須盡早地在發病初期采血，分離血漿(以少量肝素抗凝，切勿用枸櫞酸鈉或草酸鈉，以免腦內注射時引起驚厥)或血清。上述腦組織、血漿和血清等待檢材料可以接種小鼠、豚鼠、雞胚、新生雛雞或倉鼠腎原代細胞、雞胚或鴨胚原代細胞以及BHK21等細胞株。小鼠:取3周齡小鼠(乳鼠更為敏感),腦內接種002～003ml。皮下和腦內或腦內和腹腔同時接種(02～03ml)，效果更好。接種後每天觀察1～2次直至第10天。小鼠常在3～5天發病，發病時被毛逆立，弓背，畏寒(鑽入墊料中)，離群，抽搐，痙攣,最後死亡。豚鼠:取150～200克體重的幼年豚鼠，腦內接種01～02ml待檢材料，通常於3～4天發病死亡。也可作皮下和腹腔注射，但病毒分離率不如腦內接種。新生雛雞:剛出殼的雛雞(又稱濕雛)對EEEV和WEEV極為敏感，特別是在腦內接種時，可以用其分離極微量的病毒，是初次分離病毒的理想實驗動物。雞胚:可將1～2滴待檢材料直接接種於9～10日齡雞胚的絨毛尿囊膜上，也可取02ml注入尿囊腔內。雞胚通常在15～24小時內死亡，胚體和絨毛尿囊膜含有大量病毒。組織培養細胞:以原代鴨胚或雞胚細胞和倉鼠腎細胞最為敏感。可將待檢材料稀釋為10-2～10-5的不同濃度，接種單層細胞，置37℃吸附30～60分鍾後，加入維持液，繼續置37℃培養，出現細胞病變(約5天)即可收毒，供進一步傳代或鑒定用。將原始病料作不同濃度稀釋後分別接種細胞培養物，是為了避免可能發生的病毒幹擾現象，因為,在應用細胞培養物增殖馬腦炎病毒時，接種高濃度病毒有時反而不產生細胞病變。由於病毒對酸敏感，在細胞培養過程中，應定期加入碳酸氫鈉液於細胞培養液中，使pH保持在76～78左右。
(2)病毒的鑒定:通常采用交叉中和試驗。最簡單的方法是用小鼠或豚鼠作動物中和試驗，即用抗EEEV和抗WEEV的高免疫血清分別與100個小鼠或豚鼠LD50的待鑒定病毒混合，置37℃感作1小時後，接種小鼠或豚鼠，如果抗EEEV的高免血清保護動物(不死亡)，而抗WEEV的高免血清沒有保護作用，則證明待鑒定病毒是EEEV，反之亦然。也可應用組織培養細胞進行測定。如上將100個TCID50的待鑒定病毒分別與EEEV和WEEV的標準血清混合並感作後，接種細胞培養物，根據細胞培養物是否出現細胞病變，判定病毒的種或型。蝕斑減數試驗可用作毒種或毒型的鑒定，即在蝕斑技術的基礎上進行病毒中和或交叉中和試驗。具體方法是:先行測定待鑒定病毒在某種細胞培養物上的蝕斑形成能力，隨後用10%脫脂乳鹽水將病毒適當稀釋，使其可在某種培養瓶內形成適當的蝕斑數，在90×50mm培養麵積的長方形培養瓶中形成200個左右的蝕斑。另取抗EEEV和抗WEEV的標準免疫血清,用05%水解乳蛋白(以Hanks液配製)做成2×10-1和2×10-2的稀釋液，分別與等量的上述病毒液混合，按蝕斑技術的方法接種單層細胞。由於免疫血清能夠明顯抑製相應病毒的蝕斑形成，故可根據兩種標準血清的抑製程度(至少相差50%以上)，判定該病毒的種或型。必須指出，EEEV和WEEV以及它們與其它甲病毒成員在血清學試驗以及免疫保護試驗中可能發生的交叉反應，不僅決定於毒株本身，而且與免疫血清的製造方法、效價以及試驗時的條件有關。因此，應當通過預備試驗，規定標準的抗原和抗原製品，並且多做對比試驗，建立標化的測定方法。切不可根據隨便取來的免疫血清所做的一次測定結果，就下結論。亞型和抗原變異株的鑒定可以用針對E1或E2糖蛋白的單抗進行血凝抑製試驗(HI),或者采用寡核苷酸指紋圖技術加以鑒別。
(3)病毒抗原的檢測:檢測病毒抗原，是快速診斷的主要手段。可以應用固相反向補體結合試驗，但需要瀕死期或新死亡動物的腦組織作為被檢材料。也可將瀕死期或新死亡動物的腦組織作成抗原後用EEEV和WEEV的標準免疫血清進行常規補體結合試驗，檢測抗原。應用免疫電鏡鑒定WEEV可獲得理想結果。在025ml的感染尿囊液內加入等量高免雞血清(最後濃度1∶25)，37℃感作30分鍾，負染後檢查可見團聚在一起的病毒粒子。Pelegrino等(1993)建立了雙抗體ELISA和間接免疫熒光法，用於快速檢測EEEV。實驗表明這兩種方法檢測EEEV與中和試驗相比，符合率為100%。前者可在病毒接種細胞6～8小時檢測出病毒抗原。最近，一些研究工作者建立了快速、敏感和特異的分子診斷方法,用於檢測EEEV、WEEV和VEEV以及其它甲病毒。建立的RTPCR法可以敏感而特異地檢測蚊和鳥類組織器官中的EEEV或WEEV，從而監測病毒的活動，以預報何時在何處實施對蚊的控製，以減少人和動物感染的可能性。該方法既可檢測出單隻感染的蚊，也可用於人和動物的早期診斷。Vinskaia等(1992)根據甲病毒基因組3端的序列特點，設計並製備了病毒種群特異的DNA探針，建立了核酸雜交檢測方法，可以特異地檢測和鑒定EEEV、WEEV或VEEV等甲病毒的RNA。該方法敏感性高，可檢測出1ng的病毒RNA。
(4)特異性抗體的檢測:血凝抑製抗體與中和抗體的出現，一般可在發病後檢出，並可持續數月之久。補體結合抗體出現較晚，須在發病10天以後才能檢出，持續時間也較短，約幾個星期。抗體檢測主要用於流行病學調查。對於臨床病例的診斷，則應采取急性期和恢複期的雙份血清，比較兩者的抗體效價，以增高4倍以上者具有診斷意義。目前已建立了兩種檢測EEEVIgG和IgM抗體的方法，一種是抗體捕捉ELISA法，它可做為血凝抑製試驗(HI)和中和試驗的補充，用於馬群中EEEV感染的診斷，該方法可以鑒別是最近感染還是先前的免疫接種。在急性前期的病例中，IgM和IgG陽性(ELISA檢測)、中和抗體陰性，但HI抗體陽性，在急性期的病例中，IgM和HI抗體陽性，但IgG和中和抗體陰性，在過渡期的病例中，這4種抗均為陽性。在ELISA中IgM抗體是病毒特異的，它不與WEEV和VEEV發生交叉反應。另一種是酶免疫測定法(EnzymeImmunoassay,EIA),該方法可用於檢測雞感染EEEV後所產生的抗體,在雞感染病毒後2～4天即可檢測出IgM和IgG的產生，與蝕斑減數中和試驗和HI試驗檢出抗體的時間一致。雞感染病毒30天後，就測不出IgM,所以該方法可以通過鑒別雞群的感染時間來監視病毒在雞群中的流行狀況。
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