豬水皰病病毒-腸道病毒屬(Swine vesicular disease virus) 豬水皰病是近30年來新發現的一種豬的疫病。1966年10月首先發現於意大利Lombardy的豬群 中，認為這是一種在臨床上與口蹄疫具有相似症候群的疾病。該病同時發生在兩個豬場，都 因從同一來源引進豬而發病。意大利的Brescia口蹄疫研究所和英國的Pirbright動物病毒研 究所進行了一係列檢驗，都未能證明有口蹄疫病毒的存在，但發現一種腸道病毒，因此一致 認為這是不同於豬口蹄疫、水皰性口炎和水皰疹的一種新的豬的水皰性疾病。這些疾病雖然 臨床上相似，但可通過病原的理化學特性鑒定、動物接種和血清學等方法加以鑒別(見表16 - 11)。香港地區隨後也發現豬水皰病。Mowat、Darbyshire和Huntley等報道(1972年)， 於1971年4月在香港新界一些農場中發現危害於豬的一種疫病，發病率比口蹄疫低，病情也 較溫和，通常不引起死亡。經檢驗，香港地區的病毒與口蹄疫無關，而與意大利1966的病 毒相似，因此確認香港的豬水皰性疫病，也是由豬的一種腸道病毒所致。
英國從1972年12 月到1973年4月發生89個水皰病疫點；隨後豬水皰病又發生於波蘭(1972年)、奧地利(1972年 )和法國(1973年)。意大利於1972年10月重新暴發。以後在比利時(1973)、前西德(1973年) 、 東歐一些國家(1972年冬至1973年春)、瑞士(1974年)和荷蘭(1975年)等國也相繼發生了豬水 皰病。日本於1973年12月第一次在三個縣的15個豬場內發生豬水皰病。由於在歐洲的許 多國家相繼發生豬水皰病的流行蔓延，引起了世界肉食市場的混亂，1973年1月國際獸疫局 對此極為重視，專門召開會議，研究措施，製定條例，並在這次會議上正式定名為“豬水皰 病”。豬水皰病引起嚴重的經濟損失，以英國為例，1972年至1973年撲殺、銷毀42814頭 豬 ，價值100萬英鎊，1972年至1974年僅賠償費一項就花費440萬英鎊。
1、形 態特征 水皰 病病毒在電子顯微鏡下呈球形，超薄切片中的病毒粒子的直徑為22～23nm，磷鎢酸負染法測 定為28～30nm。Liebermann等測定病毒粒子的平均直徑為251±10nm，由裸露的二十麵 立 體對稱的衣殼和含有單股RNA的核心組成。在負染標本中，可見衣殼由許多空的圓筒形殼粒 構成。水皰病病毒在細胞胞漿內複製，成熟的病毒粒子經常呈晶格狀排列，在發生病變的 細胞的胞漿空泡膜內凹陷處形成特異的環形串珠狀排列。這種特異的排列結構在病變中期的 宿主細胞內是能經常見到的，偶而也可在一個細胞內同時看到病毒的晶格狀排列和環形串珠 狀排列。串珠狀排列的病毒粒子的形狀與大小非常均一，呈圓形，大小與晶格排列的病毒粒 子完全一致。在感染的倉鼠腎細胞培養物中，還常可以見到由纖維樣結構包圍起來的小體 ，小體內充滿著病毒粒子。
2、理化學特性 水皰病病毒的 沉澱係數為150±3S，分子量為 104×106Da。關於水皰病病毒的結構蛋白，Delagneau等應用1％十二烷基 硫酸鈉(SDS)和05mol/L尿素緩衝液100℃加熱一分鍾的方法，使病毒裂解，隨後在聚丙烯 酰胺凝 膠中進行電泳，發現水皰病病毒粒子及空衣殼中有分子量分別為38 000和30 000 Da的兩 種 多肽存在。空衣殼體的電泳圖像分成VP1及VP2兩個峰，但完整病毒粒子的兩個峰並不完 全分開，在VP1和VP2兩峰之間有輕度的重疊。水皰病病毒的電泳泳動能力不同於口蹄 疫病毒，水皰病病毒的VP1比口蹄疫病毒的VP1泳動得遠，VP2也比口蹄疫的VP2泳動 略遠。估計水皰病病毒VP1的分子量在37 000～39 000 Da之間，VP2的分子量在29 00 0～ 31 000 Da之間。根據豬水皰病病毒在氯化銫中的浮密度，又有浮密度為134g/ml的“ 輕 組分”以及浮密度為144g/ml的“重組分”兩種。約有98％的感染力寓於“輕組分”中。 “ 輕組分”和“重組分”都有相同的RNA和蛋白質比例以及相同的多肽成分。在病毒複製過程 中，每一種成分又都產生同樣比例的“輕”、“重”兩個組分。水皰病病毒的“輕”、“重 ”兩種組分在酸性環境條件下都具有穩定性，不受pH30的影響，“重組分”的顆粒大小為 282±076nm，“輕組分”的顆粒大小為301±074nm，略大於“重組分”。在刺激機 體產生血清中和抗體的能力上，“重組分”的效力低，“輕組分”的效力高。尚未發現豬 水皰病毒有凝集紅細胞的作用。
3、抵抗力 水皰病病毒抵 抗乙醚和氯仿。1mol/L濃度的MgCl 2明顯提高病毒在50℃的穩定性。水皰病病毒在pH50、 40和30時皆穩定。據Hern iman 氏的報道，病豬糞便和血液中的水皰病病毒於pH39～96和5℃溫度下，可以存活164天， 不 喪失其感染性；但pH值低於288及高於1076時，則在164天後失去感染性。60℃2～10分 鍾 可使病毒滅活。 糞便中的 病毒在環境溫度為12～17℃時，可存活138天；但當環境溫度為25℃時，約28天病毒就被滅 活。動物屍體在-20℃經11個月仍有大量感染性病毒存在。2％氫氧化鈉溶液在25℃ 作用24 小時，使水皰病病毒滅活，但在0～4℃24小時，則尚不能滅活病毒。其它如5％氨水、3％福 爾馬林，都可殺滅病毒。1％過氧乙酸和次氯酸鈉能在短時間內殺滅水皰病病毒。細胞培 養的病毒液在37℃下經144小時失去對細胞的致病變作用。用福爾馬林加氧化劑於25℃左 右溫度下薰蒸密閉的廄舍18～24小時，可以達到消毒目的。
4、增殖 應用原代仔豬腎細胞以及IBRS2、PK15和人羊膜傳代細胞FL等培養豬水皰病病毒，都 可產生明顯 的細胞病變：細胞變圓，固縮而呈顆粒狀，聚集成堆或散在。這些病變一般出現於接種病毒 後30多個小時。適應株甚至可在接種後10小時左右引起細胞病變。豬水皰病病毒易在IBRS 2傳代細胞上複製增殖，IBRS2細胞似乎對豬水皰病病毒特別敏感，每ml病毒液可達2×1 09個蝕斑形成單位。蝕斑呈圓形，邊緣整齊，通常在接種病毒後20小時開始出斑，48小時 的蝕斑直徑為30mm左右，72小時可達60mm。水皰病病毒對牛源細胞培養物(如原代犢 牛腎細胞、原代犢牛甲狀腺細胞)和BHK21細胞不引起細胞病變。對原代鼠胚細胞和HeLa細 胞係能否產生細胞病變，報道尚不一致。某些水皰病病毒株較難適應原代倉鼠腎細胞，初 代感染接種時不出現細胞病變，但經檢驗卻確有病毒存在。需傳到20代左右時才能出現規律 性的細胞病變。另外一些毒株較易適應原代倉鼠腎細胞，並產生比較明顯的細胞病變。水 皰病病毒感染的細胞培養物，在用免疫熒光抗體檢查時，可在病毒接種後3～5小時，就在胞 漿內看到顯示熒光的顆粒，這表明在胞漿內此時就有病毒成分的產生。原來認為水皰病病 毒和口蹄疫病毒在細胞培養中存在幹擾現象，但是後來證明，在同一細胞培養物中同時或先 後接種二種病毒，都能產生較高的病毒滴度。
5、病原性 豬水皰病病毒除對本動物(豬) 引起感染發病外，對其它家畜、家禽，如奶牛、水牛、黃牛、綿羊、山羊、馬、驢和雞等均 不引起發病。病豬發熱(41～42℃)，並於鼻鏡、蹄冠、蹄球和趾間皮膚上出現水皰。水皰直 徑1～3cm，常在2～3天內融合和破潰，並迅速愈合。皮下或皮內注射感染組織浸液或水皰液 於蹄球或蹄冠部，常可在36小時內於接種部或其周圍出現水皰。此後迅速發展為全身感染， 並於趾間、鼻鏡和舌上出現水皰。實驗動物，如2～3日齡的乳鼠和1～2日齡的乳倉鼠、吮 乳大白鼠都能感染發病。乳鼠表現特異的麻痹症狀：四肢後伸，強直。初代分離時病程較長 ，小鼠在感染後5～6天死亡，用1045TCID50滴度以上的病毒腹腔接種乳鼠， 於接種後3～8天內引起麻痹死亡。7日齡以上的小鼠大多具有抵抗力。幼齡家兔不感染。多 數學者認為水皰病病毒不能引起豚鼠發病，但有人用蹠部皮內穿刺接種法強迫適應，據雲幾 代後可以使蹠部出現輕度的水皰性炎症。水皰病病毒不感染雞胚。
6、抗 原性 豬水皰 病病毒同口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒和水皰疹病毒沒有交叉免疫反應，四種病毒雖然都使 動物產生相似的臨床症狀，但抗原性不同。有人應用補體結合試驗研究豬水皰病毒各毒株 之 間的關係，將英國／1972、意大利／1966、法國／1973及香港／1971等4個毒株作交叉補結 試驗。從測定它們的R與r值的關係來看，4個毒株之間僅有微小的差異，這個差異同口蹄疫 亞型之間的差異值類似。在中和試驗中，意大利／1966株、香港／1971株和法國／1973株彼 此不同，且與意大利／1972、英國／1972、澳大利亞／1973和波蘭／1973群毒株不同。瓊脂 擴散試驗也證明幾個毒株之間存在一些差異。應用RNase T1單向PAGE技術對不同時間、不 同地 區分離的8株水皰病病毒進行比較，發現其可以大致分為三組，但均與日本／86參考株存在 差異。曾對不同地區的流行毒株進行豬體交叉免疫試驗，結果幾個地區的毒株沒有表現出 太大的差異，互相能夠交叉免疫。Graves等(1976年)首次報道了豬水皰病病毒與人的一種 腸道病毒 柯薩奇病毒的關係，並且推測這種病毒可能是由人傳給豬的。該氏用抗 柯薩奇病 毒的血清對豬水皰病病毒進行中和試驗，結果證明，無論是在細胞培養物上或於小鼠腦內接 種時，豬水皰病病毒都可被柯薩奇B5型血清所中和。另外，以B5型柯薩奇病毒和豬水 皰病病豬的康複血清進行中和試驗，以PK15細胞為指示細胞，也都出現明顯的交叉中和現 象。人的B5型柯薩奇病毒經用各種方法感染豬，都不引起臨床症狀，但在豬體內卻可產 生高效價的中和抗體，這說明病毒在豬體內是有活性的。迄今尚未見有人類感染豬水皰病 的報道，但與水皰病病畜有接觸史的人或在實驗室內進行此項工作的人，體內確能查到高效 價的水皰病病毒的中和抗體。豬水皰病病毒和B5型柯薩奇病毒之間的上述血清學關係， 似可說明豬水皰毒病毒在人與豬之間傳布的可能性。因此有人斷言：豬的水皰病病毒很可能 就來源於人。Brown等(1976年)通過血清學和RNA雜交試驗發現近期分離的B5型柯薩奇 病毒8068株、9954株與原始Faulkner毒株有著明顯的差異；而水皰病病毒與Faulkner毒株之 間的關係卻比上述二株B5型柯薩奇病毒株與Faulkner毒株之間差異要小。Harris等(1 975年)也對豬水皰病病毒和B5型柯薩奇病毒的多肽成分與抗原差異的關係進行了研究。通 過RNA雜交試驗，發現水皰病病毒與原始的柯薩奇B5型(Faulkner)毒株，大約有50％的同 源性，而原始型柯薩奇病毒與後來分離的柯薩奇病毒株(如8068株、9954株)的RNA也有較大 差異。這說明後來分離的毒株已經有了某些改變，而且水皰病病毒與柯薩奇病毒二者之間有 著比較密切的親緣關係。用35S蛋氨酸或3H氨基酸標記的水皰病 病毒和B5型 柯薩奇病毒，混合後在15%～45％(重量／體積)的蔗糖密度梯度中作離心沉澱試驗，結果也 發現兩種病毒的沉澱係數相似，而在氯化銫中的浮密度二者也相同 134～135 g／ml。用 十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解病毒粒子，再作聚丙烯酰胺凝膠電泳，可見水皰病病毒和B5型 柯薩奇病毒的多肽圖形不同，但各國在不同時間分離的水皰病病毒之間的多肽圖形也有顯著 不同。由個別地區分離的水皰病毒株(如法國1／73)，其多肽圖形很像近期分離的B5型柯 薩奇病毒。
7、傳播 病豬的病變上皮組織和水皰液中含有 高效價的病毒，也可由淋巴結 、骨髓、扁桃體、肝髒和血液中分離到病毒，但含毒量較低，且較快消失。肌肉中的病毒含 量不高，但也曾有由患病後15天左右的病豬肌肉中分離到病毒的報道。病豬可由鼻腔 和 口腔排毒，持續10天左右，也可隨糞排毒6～12天。曾有尿亦含毒，且能直接致死1～3日齡 乳鼠的報道。豬水皰病的主要傳播方式是直接接觸感染。當健豬與病豬或帶毒豬同居混群 飼養，或用汙染的飼料、泔水喂豬時，使健康豬感染發病。病毒可經損傷的皮膚直接侵入機 體到達敏感部位 蹄、鼻鏡和口腔上皮組織，並形成特征性的水皰；也可經口感染 ，從消化 道經血液到達敏感部位產生水皰。豬水皰病的流行無嚴格季節性。當豬隻調動頻繁，大量 集中，氣候變冷時，發病率增高，達50％～90％。農村一家一戶飼養的豬的發病率較低。 豬水皰病病毒的傳播力不如口蹄疫病毒，所以流行比較緩慢，不呈席卷之勢。鼻鏡上出現水 皰的豬也不如口蹄疫多。英國在1972～1973年豬水皰病流行期間，發現本病的傳播主要通 過三個途徑：(1)用屠宰場病豬的殘屑或下腳料喂豬；(2)買進病豬，直接傳播；(3)用汙染 的交通工具運豬。被水皰病病毒感染的母豬所生的2～3日齡的仔豬也可發生感染，出現水 皰。野豬也被感染，呈現與家豬相同的症狀。Sasahara等(1980年)從健康豬的糞便中分 離獲得1株可被水皰病免疫血清中和的病毒，因此認為豬群中可能存在隱性感染。
8、免 疫 動物在自然感染水皰病後4天即在血液內出現一定滴度的中和抗體，且 能持續較長時間 。恢複動物可產生堅強的免疫力。人工免疫接種也有良好的免疫效果。(1)弱毒疫苗① 鼠 化弱毒苗：係將自然流行的豬源強毒連續通過2～3日齡乳鼠30代以上而減毒育成的。病毒滴 度(LD50)一般可達10-70左右。製苗時應用30％甘油鹽水製備成感染乳 鼠肌肉 組織苗。免疫劑量為1∶100～500倍2ml。注射幼豬，應不引起臨床症狀，攻毒時保護力應 在8 0％以上。免疫持續期可達6個月。此苗可與豬瘟兔化弱毒疫苗共用，不影響各自的效果。 ②細胞培養弱毒疫苗：係用原代仔豬腎細胞培育的弱毒株，病毒在接種後20～30多小時產生 中等度明顯的細胞病變，病毒滴度(TCID50)可達10-70～10- 80。一般 經40、50代致弱，但也有需經70代以上才能致弱的。組織培養弱毒苗對豬可能產生輕微反應 ，但不引起同居感染，是目前安全性較好的弱毒苗。但個別毒株在連續傳100代以上也不明 顯致弱，接種後還可引起同居感染，毒力迅速返祖。細胞培養弱毒疫苗的免疫保護率多在80 ％以上，免疫期可達4～5個月。細胞培養物中加入20～30％的甘油，可以提高疫苗的保存期 。也有應用仔豬睾丸細胞、胎豬腎以及倉鼠腎細胞或IBRS2細胞馴化培育 的弱毒疫苗株 。一個理想的弱毒疫苗株，應該既能在動物體內增殖，但又不能產生組織損傷，且在敏感 動物體內多次傳代後，繼續保持穩定特性。遺憾的是，經上述途徑馴化培育的幾個弱毒疫苗 株，均未完全符合這樣的要求，實際應用中暴露出了許多弊病，目前已經基本停用。(2) 滅活疫苗細胞培養滅活苗:原代仔豬腎細胞、倉鼠腎細胞和IBRS2傳代細胞均可用於疫苗 生產。細胞培養物的病毒滴度,TCID50為10-75左右,乳鼠LD50為10 -60以上。用最終濃度為01％的甲醛或006％的β丙內酯或005％的乙酰乙烯亞 胺(A EI)作為滅活劑。應用二乙烯亞胺(BEI)的效果更好。於4℃、26℃或37℃滅活6～24小時。佐 劑可用氫氧化鋁、油乳劑或氫氧化鋁皂素。疫苗安全可靠。注射量為3～5ml,注苗後7 ～10天產生免疫力。免疫保護力在80％以上。注射後4個月仍有堅強的免疫力。(3)被動免 疫 高免 血清在應急情況下,可以應用自然發病後痊愈的豬血清,也可應用人工製備的豬高免血清, 作緊急預防接種。如果配合其它安全防製措施,可獲良好效果。康複豬血清一般采自自然痊 愈後一個月的 豬,血清中和效價應在log35～40以上。每頭豬注射4～8ml。自然痊愈康複後1個月的 豬 ,再經一次人工攻毒 1∶5病毒液40ml多點注射。攻毒後15天采血,血清中和效價可 達log55。 每公斤體重注射02ml,可獲得良好的被動免疫力。免疫期達30天。在飼養期短,周轉快, 調 動頻繁的商品豬群中,合理使用高免血清的被動免疫方法,常可達到預防本病的效果。
9、 診斷 豬水皰病在臨床症狀、病理剖檢變化上很難與口蹄疫等水皰性疾病相 區別,所 以診斷本病的主要著眼點就是將其與口蹄疫等疾病進行鑒別,請參閱表16-11。(1)病 毒分離: 采取病豬的水皰皮,洗淨、稱重並研磨後,用生理鹽水或磷酸鹽緩衝液製成1 ∶5～1 ∶10懸液,置4℃浸出一夜或在室溫浸出4小時。振蕩混合後,以3 000r／min離心沉澱10分鍾, 其上清液即為待檢病毒液。頸部皮下接種2～3日齡的乳鼠或乳倉鼠,或者IBRS2 、PK15等豬 腎傳代細胞。一般在最初1～2代內即可引起感染,實驗動物發病、死亡,或使組織培養細胞出 現細胞病變。如果初代分離呈陰性結果,應繼續盲傳2～3代。(2)中和試驗:中和試驗是 診斷豬水皰病的常用方法,較易得出確切的診斷結果。①用已知血清鑒定未知病毒:選用2 ～3日齡的乳鼠,每窩10隻,各以1隻母鼠哺乳。分別注射已知的豬水皰病免疫血清和口蹄疫各 型免疫血清。每窩注射7隻,留3隻不注射,作為病毒對照。注射的豬水皰病免疫血清不稀釋, 口蹄疫血清測作1:4稀釋。每隻頸背部皮下注射01ml。於注射血清後18～24小時,接種如 上製備的待檢病毒液。於每窩注射過血清的7隻乳鼠中,5隻接種病毒液,留2隻作為血清健康 對照。3隻未注射免疫血清的乳鼠,也同時接種病毒液。每隻頸背部皮下注射01ml。接種 病毒後,每天觀察2～3次,連續觀察6天。如注射豬水皰病免疫血清的乳鼠被保護,血清對照鼠 均健活,病毒對照鼠和注射各型口蹄疫免疫血清的乳鼠均發病死亡,則被檢病料為豬水皰病 病 毒,而不是口蹄疫病毒。②用已知病毒鑒定未知血清:於待檢血清中每ml加青、鏈黴素各1 000單位,室溫處理1小時,或4℃處理4～5小時。選用2～3日齡乳鼠,每窩10隻,各以1隻母鼠 哺乳。以如上處理的待檢血清注射,每窩7隻,留3隻不注射作為病毒對照。每隻乳鼠頸背部皮 下注射01ml。於注射被檢血清後18～24小時,用豬水皰病病毒及口蹄疫各型病毒進行接 種 。每一病毒接種一窩乳鼠。在每窩注射過被檢血清的7隻乳鼠中,給5隻接種病毒,留2隻作血 清健康對照。未注射血清的3隻乳鼠也同時接種病毒。每隻乳鼠頸背部皮下注射01ml病毒 液(10-2～10-3稀釋,約含10 000LD50)。攻毒後觀察6天,每 天觀察2～3次 。如果接種豬水皰病病毒的乳鼠被保護,血清對照乳鼠健活,而豬水皰病病毒對照鼠以及用各 型口蹄疫病毒攻擊的乳鼠均發病死亡,則被檢血清中含有豬水皰病抗體,而不含有口蹄疫病毒 抗體 。必須指出,由於口蹄疫和豬水皰病的廣泛存在,同一份血清中可能同時具有抗口蹄疫抗體和 抗水皰病抗體。(3)反向間接紅細胞凝集試驗:一般應用丙酮醛甲醛法或戊二醛 甲醛法 固定綿羊紅細胞,並以提純的豚鼠抗水皰病IgG致敏,製成水皰病紅細胞診斷液。IgG的最適濃 度為50～100μg／ml,致敏過程在pH40的01mol/L醋酸緩衝液內進行。具體操作方法請參 閱本書 第十四章有關節段。水皰病紅細胞診斷液在4℃可以保存5個月。 試驗在微量 滴定板上進行。先將被檢材料(如水皰皮)用pH72, 011mol/L磷酸鹽緩衝液或生理鹽水 洗 淨,稱重後研磨,作成1∶3懸液,如上浸出製成待檢抗原。隨後將其在小試管中用內含1％兔血 清、005％聚乙二醇(分子量12 000)和01％疊氮化鈉的pH72,01mol/L磷酸鹽緩衝液 作倍倍稀釋 ,自1∶6、1∶12……1∶768。於微量滴定板的第一排1～8孔內分別滴加8個不同稀釋度的 待檢抗原,每 孔2滴。第9孔滴加稀釋液2滴,作為陰性對照。第10孔滴加水皰病標準抗原1:30稀釋液2滴,作 為陽性對照。隨後於1～10各孔內滴加水皰病紅細胞診斷液1滴,輕輕搖震滴定板,使紅細胞 均勻懸浮後,置室溫下感作15～20小時後判定結果。有兩孔出現++以上凝集現象者,即 可判為 水皰病,但陰性對照孔應不凝集,陽性對照孔應凝集。紅細胞凝集++以上的抗原最高稀釋度 ,即為該被檢抗原的效價。反向間接紅細胞凝集試驗雖然靈敏度較高,但個別被檢抗原可能 在 低倍稀釋孔內出現非特異凝集現象。必要時,應以正常對照豚鼠的IgG同樣致敏已固定的綿羊 紅細胞,製成對照正常紅細胞診斷液。試驗時,將待檢抗原如上稀釋後同樣滴加於微量滴定板 的第1排和第2排的1～8孔內,第9和第10孔仍為陰性、陽性對照。隨後於第1排各孔內加入水 皰病紅細胞診斷液,第2排各孔內加入對照正常紅細胞診斷液。如上感作、判定。比較第1排 和第2排的凝集情況,根據兩排凝集滴度之差進行判定,以相差兩孔以上者為陽性。(4)免疫 熒光抗體法:將豬水皰病的水皰皮浸出液接種細胞培養物,隨後用熒光抗體鑒定細胞內的病 毒抗原。方法是在培養於飛片上的IBRS2、PK15或原代仔豬腎細胞單層上接種如上製 備的1∶10水皰皮浸出液02ml,吸附並補加維持液後,37℃孵育,經不同時間後取出飛片,以- 20℃甲醇固定30分鍾,晾幹後,滴加20倍稀釋的豚鼠抗水皰病免疫血清02ml,37℃感作30分 鍾,用PBS充分衝洗後,再加熒光素標記的兔抗豚鼠IgG，37℃染色30分鍾。經PBS充分衝洗後, 晾幹,鏡檢。應用大孔培養板培養細胞,直接接種水皰皮浸出液後,如上熒光染色,當然更為方 便。同時設豬水皰病病毒陽性和陰性對照培養物以資比較。陽性病料於接種後5小時開始 出現熒光細胞,並隨時間的延長,熒光細胞數增多。但如病料中的病毒含量低,則常推遲至接 種後10～24小時才能檢出陽性細胞。也可應用熒光抗體直接染色法,其與間接法的檢出結 果相 似。應用熒光抗體直接檢測病料,如水皰皮,效果常不理想。豬水皰病病毒和口蹄疫病毒在 熒光抗體檢查時不發生交叉反應。(5)補體結合試驗:一般應用微量補體結合試驗,各成 分的用量為0025ml。試驗在微量滴定板中進行。添加溶血係統之前,置37℃感作結合1～4 小 時或4℃18小時。後者的檢出率略高於前者。將水皰皮等被檢病料如上作成浸出液後直接 檢 測。(6)酶聯免疫吸附試驗(ELISA):檢測病料或細胞培養物中的病毒抗原,一般應用雙抗 體夾心法:應用提純的豬或豚鼠高免血清(見“附”)IgG,包被40孔酶標板,作為固相載體;隨 後滴加被檢抗原,感作並衝洗後,用含10％馬血清的PBS液封閉,37℃感作並衝洗後,再加酶標 記的同源(豬或豚鼠)高免血清IgG,即酶結合物。再經感作和衝洗,最後加入底物顯色,測定O D值進行判定。有人應用抗水皰病病毒的單克隆抗體製備酶結合物,據雲檢測效果更為理 想。也可應用瓊脂擴散試驗和放射免疫測定等診斷方法,請參閱本書第十四章有關內容。 附:豬水皰病豚鼠高免血清的製造 1、抗原製備 選用抗原性良好的豬水皰病乳鼠 適應毒,接種乳鼠,待其發病瀕死時采取感染肌肉組織,在磷酸鹽緩衝液或生理鹽水中研磨成1 ∶2～1∶3懸液。於4℃浸出過夜,3 000r／min離心沉澱10分鍾,吸取上清液。病毒滴度(LD 50)需在10-7以上。保存於4℃冰箱內備用。 2、免疫注射方法 選用體重在500g左 右的健康豚鼠10～15隻,免疫注射4次,各次間隔4～5天。方法和劑量如下:第一次 兩後肢 腳掌穿刺接種04ml,皮下06ml;第二次 皮下注射15ml,肌肉注射05ml(加 05％皂素); 第三次 皮下注射30ml,肌肉注射15ml(加05％皂素);第四次皮下注射60ml。於最 後一次注射後的第10～12天,心髒采血,分離血清。56℃滅活30分鍾後,加防腐劑,分裝備用。 3、效價測定 將血清作成1∶5、1∶10、1∶20、和1∶40稀 釋液,分別注射2～3日齡乳 鼠7隻,每隻頸背皮下01ml。18～24小時後用10-2稀釋的豬水皰病病毒攻擊。同時設 血清對 照和病毒對照各2隻。觀察6天。血清的保護效價應在1∶5以上。血清效價遠較康複豬血清為 低,可能是豚鼠對水皰病病毒比較鈍感的緣故。 4、特異性檢查 將血清作1∶5稀釋 ,注射5窩乳鼠,每窩注射7隻,每隻頸背部皮下01ml。18～24小時後分別用10-2～10 -3 的口蹄疫各型病毒和水皰病病毒攻擊,每隻頸背部皮下注射01ml。另設血清、病毒對照各2 隻,觀察6天。如果血清對照乳鼠健活,而以各型口蹄疫病毒攻擊的乳鼠均發病死亡,以水皰病 病毒攻擊的乳鼠被保護,即證明血清的特異性良好。
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