口蹄疫病毒診斷

診斷 口蹄疫的臨床診斷根椐症狀，亦即口和蹄部的水皰和爛斑， 並考慮流行病學材料。由於口蹄疫、水皰性口炎、水皰疹和豬水皰病等4種疾病極為相似 ，故應首 先加以鑒別。如果補體結合試驗和免疫保護試驗不能作出最後結論，則應進行病毒理化學特 性鑒定、細胞感染範圍試驗以及動物接種試驗，見表16—11。在已確定為口蹄疫病毒之後， 再作型和亞型的鑒定。毒型鑒定包括生物學和血清學兩種方法。生物學方法是用牛、豚鼠或 乳鼠進行交叉免疫試驗以及應用豚鼠和乳鼠進行血清保護試驗。血清學方法包括補體結合試 驗、中和試驗和瓊脂擴散試驗。(1) 病毒的分離：自患畜病料中分離病毒，是最可靠的 診斷方法。通常應用實驗動物、雞胚和組織培養細胞。病料的采取與保存是否恰當，直接 影響分離的成功率。一般采取水皰皮和水皰液作為病毒分離材料。牛應采取舌表麵的水皰皮 ，蹄叉和蹄冠部的水皰皮常有比較嚴重的細菌汙染。豬則采取鼻突部或蹄叉間、蹄冠的水皰 皮。水皰皮應早期采取，亦即選擇新鮮未破潰的水皰。已經潰爛或腐敗的水皰皮不宜作病毒 分 離用。水皰皮必須同時采自幾頭病畜：牛2頭以上，豬5頭以上。采取後立即投入50%甘油磷 酸鹽緩衝液內，並迅速冷藏。水皰液在無菌條件下采取，可用滅菌的1～2ml注射器直接由未 破潰的水皰內抽取。也可應用食管探杯(cup probang)采集牛羊的食管-咽頭分泌液， 每次 5ml，采集後立即加入等量的細胞培養用維持液，並劇烈振蕩1分鍾後應用或保存備用。  表16-11口蹄疫病毒與三種水皰性病毒的區別 口蹄疫病毒 水皰性口炎病毒 豬水 皰疹病毒 豬 水皰病病毒 (一)歸屬

 欲將病料送至遠處檢驗時,應將其置於盛有冰-鹽混合物的保溫瓶。①應用實驗動 物的病毒分離法:常 用乳鼠和豚鼠分離與鑒定病毒。 乳鼠接種 〓將病畜水皰皮置於平皿內,以 滅菌的pH76磷酸鹽緩衝液衝洗4~5次,並用滅菌濾紙吸幹。稱重後置於滅菌乳缽中,剪碎,加 入適量海砂磨成糊狀。按水皰皮重量加pH76的磷酸鹽緩衝液製成1:5的懸液(懸液濃度可按 實際情況適當增減)。如有水皰液,可在此時加入。為防止細菌汙染,每ml加入青、鏈黴素各1 00 0單位,置2~4℃冰箱內浸毒4~6小時,然後以3 000r/min的速度離心沉澱10~15分鍾,吸取上清 液 備用。取4~7日齡乳鼠10隻,於頸背部皮下接種上述病毒感染液02ml。自接種後18小時開 始,每隔1~2小時檢查一次。如果病料內含有口蹄疫病毒,被接種乳鼠一般在接種後20~30小時 出現典型的口蹄疫症狀。發病乳鼠運動不靈活,用鑷子夾尾巴或四肢,常可發現其已失去知覺 。隨後四肢麻痹,呼吸促迫,最後死亡。如於注射後12小時內死亡,則多因注射技術不佳或其 它非特異感染所致。選出發病死亡的乳鼠,用01%新潔爾滅或2％石碳酸溶液浸泡30分鍾, 隨後將其仰臥固定於盛有石蠟的平皿或木板上,再用75％酒精棉球消毒皮膚。由正中線剪開 皮膚,並向四肢延伸,剝離皮膚,除去頭、四肢以及胃腸和膀胱等,采取骨骼肌作為接種材料。 將其研磨後製成10％懸液作傳代接種用。 豚鼠接種 〓水皰皮的處理方法同 前。選擇400g體重以上的健康豚鼠3～5隻,先剪去後肢蹠部邊緣的被毛,以75％酒精棉消毒接 種部位,再以滅菌的幹棉球擦幹。用注射器和5號針頭抽取接種液,在豚鼠兩後肢蹠部皮內垂 直穿刺6針,橫行穿刺4針,皮內穿刺注入感染液02ml,再於蹠部皮下注入02～04ml。感 染豚鼠一般在接種後36~48小時於接種部形成口蹄疫的特征性水皰,嚴重時起立困難。②應用雞胚的病毒分離法:以靜脈注射為最易感。選用12～14日齡的雞胚。在暗室內用 照卵燈找到較粗的靜脈,並用鉛筆標明其位置和血流方向。以75％酒精棉消毒後,用銼或烙印 器在卵殼上銼出或烙出一個2～3mm寬、5～6mm長的長方形(切勿割破殼膜)。再用外科刀將此 長方形的卵殼挑起、揭去,並在暴露的殼膜上滴加滅菌液體石蠟1滴,使殼膜透明。此時即可 見到靜脈。用磨過的4號針頭朝血流方向刺入靜脈內,注射1∶10的病毒液002ml。如果靜脈 內出現血流暫時中斷,靜脈呈白色,則即證明確已注入靜脈。將卵殼缺口用蠟紙或膠布封固後 ,置36～365℃溫箱中孵育。每隔24小時檢查一次。在接種後24小時內死亡者棄去。選取於 接種後72～96小時內死亡的雞胚,於0～4℃冰箱中靜置4～10小時,隨後采胚,除去頭和爪(一 般見不到雞胚病變),用肌肉作下代接種材料。如果雞胚健活,也在接種後96小時采胚,如上處 理後盲傳。③應用組織培養細胞的病毒分離法:口蹄疫病毒可在牛舌上皮、牛腎、豬腎、 豚鼠腎、倉鼠腎和兔腎等原代細胞以及豬腎和乳倉鼠等細胞係內增殖。將病毒材料置於乳 缽內用滅菌剪刀剪碎,並加適量玻璃砂或海砂研磨均勻,加入pH76的磷酸鹽緩衝液製成1∶3 的懸液。滴加抗生素溶液,使每ml懸液含青、鏈黴素各100單位。再按懸液量加入20％氯仿, 置0～4℃冰箱中浸毒4～6小時。以2 000r／min的速度離心沉澱10～15分鍾,吸取上清液,供 組織培養細胞 的感染用。選擇已長成單層的細胞管,吸出舊營養液,並以Earle氏液衝洗2次,每管接種病 毒材料005ml,置37℃溫箱中吸附60分鍾,隨後再加不含牛血清的維持液095ml(pH為76 ～7 8)。繼續置37℃溫箱孵育。在接種後24小時開始用低倍顯微鏡觀察有無細胞病變出現。一般 在接種後36～48小時即可出現比較明顯的細胞病變。吸出感染細胞培養液,置-20℃保存 或作傳 代和病毒鑒(滴)定。(2)病毒型的鑒定:通常應用O、A和C等各型標準陽性血清進行補體 結合試驗,鑒定上述分離的毒株或者直接用以鑒定病畜水皰皮內的病毒抗原。應用補體結合 試驗鑒定水皰皮內的病毒抗原,常可在2～3小時內得出結果,故是目前普遍應用的方法。鑒定 口蹄疫病毒及其型,也可應用瓊脂擴散試驗、中和試驗、酶聯免疫吸附試驗和交叉免疫保護 試驗。

①補體結合試驗反應原理和基本術式與一般補體結合試驗相同, 請參閱本書第十 四章有關節段。

 補體的工作量是滴定度再加1 ％(習慣上叫二個單位)。如滴定度為02ml,也就是在一個劑量內含2％的純補體,則其工作 量 應該是3％。本試驗更要用四個補體量。如果2單位是3％,則其餘三個量為:3單位是35％,4 單位是4％,5單位是45％。故在此條件下,補體的滴定度不能低於025ml,否則5％(即1∶2 0 )的補體就不能用了。 標準陽性血清 〓係用豚鼠製造,即用各種口蹄疫病毒 的豚鼠適應株多次免疫而得。因A和O型病毒常可引起100％或將近100％的死亡,所以需先進 行基礎免疫。選取體重500g以上的豚鼠20隻,第1次股內側皮下注射10-4稀釋病 毒液0 5ml,3～4天後注射同樣稀釋度的病毒液06ml,再隔3～4天,皮下注射10-3稀釋 病毒液 04ml。並於末次注射後7～10天以10-2稀釋的病毒液皮內注射兩後肢的蹠部皮 內。豚 鼠大多發病,但經2～3星期後痊愈,此時再作高度免疫注射。也可先用氫氧化鋁甲醛滅活疫苗 作股內側皮下注射2ml,腳掌皮內注射02ml,14天後以10-2強毒皮內注射兩後肢 蹠部,豚鼠可能發病,待其痊愈後,再作高度免疫注射。高度免疫注射時,以10-1 稀釋的 病毒液皮內注射於兩後肢蹠部,共4～5次,每次間隔3～4天,第1次02ml,以後逐漸增加,最後 一次注射05～06ml。於末次注射後7～8天心髒放血,析得血清,56℃30分鍾滅活,並加入0 1 ％杞奴鎖防腐。4℃冰箱保存備用。有效期在1年半以上。C型病毒對豚鼠的致死力較低,可 直接用10-1稀釋的病毒液作後肢蹠部皮內接種,待其發病痊愈後,再如上述用10 - 1稀釋的病毒液作高度免疫注射。

 被檢抗原 〓采取病牛 、病豬或人工感染的豚鼠水皰皮,以pH76磷酸鹽緩衝液或生理鹽水連續衝洗4～5次,用滅菌 濾紙吸幹後稱重,置滅菌乳缽中用消毒剪刀剪碎,其中加入適量玻璃砂或海砂充分研磨均勻, 再加二倍量的pH76的磷酸鹽緩衝液,放置室溫1～2小時或0～4℃冰箱浸毒24小時,取出後以 3 000r ／min的速度離心沉澱15分鍾,吸取上清液,置58℃水浴中滅活40分鍾,即為被檢抗原。如果 是用人工感染的乳鼠,則選取其在18～48小時內死亡的,無菌采取肌肉,稱量後置滅菌乳缽中, 加砂研磨成糊狀,然後加pH76磷酸鹽緩衝液,配成1∶2懸液,置室溫中浸毒1小時,再以3 000 r／min 的速度離心15分鍾,取其上清液放置58℃水浴中滅活40分鍾,作為被檢抗原。細胞培養病 毒可直接58℃滅活40分鍾後進行檢測。 標準抗原 〓用O、A和C型豚鼠適應 毒 株分別接種豚鼠後肢的蹠部皮內,經18～24小時采取注射部位形成的第一期水皰皮,如上於乳 缽內加砂研磨成糊狀,並用pH76的磷酸鹽緩衝液作成10％的懸液,室溫浸毒1小時,再以3000 r／min 的速度離心沉澱15分鍾,取其上清液置58℃水浴中滅活40分鍾,即成標準抗原。標準抗原在製 成後需以同型標準血清作效力滴定,用其它型標準血清作特異性檢查。

 反應時間完了後,可以立即評定結果,也可在6～12小時後再評定一次。各型血清中4管 都 全溶血,或僅第1管記“+”的,為陰性反應;補體3單位(第2管)以上,記“++++”的,為陽性反 應;僅第1管記“++++”的為可疑,需重複試驗。根據以上試驗結果,該被檢材料為O型口蹄 疫病毒。必須指出,在口蹄疫病毒的四種抗原中(病毒粒子抗原、12S亞單位抗原、75S空 衣殼和VIA抗原),隻病毒粒子抗原和空衣殼具有型特異性。在應用補體結合試驗定型時,往往 由於存在VIA抗原、12S抗原而受到幹擾。將待檢抗原和標準抗原以58℃滅活40分鍾,就是為 了消除這種非特異性幹擾。提高標準陽性血清的稀釋度,也有降低這種非特異性幹擾的作用 。如需進一步鑒定亞型,則可應用該型病毒中的各個不同亞型的標準血清,與被檢抗原和標 準抗原進行交叉補體結合試驗,隨後計算r值和R值進行判定。請參閱本章“抗原性”一節。 補體結合試驗也可反過來,應用已知的標準抗原檢測動物血清中的抗體,進行抗體型的鑒定 ,操作方法同上。

② 瓊脂擴散試驗 將優質瓊脂配成5％濃度,15磅 高壓30分鍾。待自然沉 澱後,將瓊脂倒於方形搪瓷盤中,凝固後切去底部雜質,並將瓊脂切成3～4mm3的小塊。置雙 餾水中浸泡48小時,每日換水三次。再用內含1／萬硫柳汞的pH76磷酸鹽緩衝液浸泡4小時 以 上,移置4℃冰箱中保存備用。這樣處理的瓊脂,在澆製瓊脂板後十分澄清,便於觀察弱陽性反 應。製板時,取瓊脂小塊50g,瀝去緩衝液,加入pH76磷酸鹽緩衝液200ml,在水浴中加熱溶化 , 溶化後加入疊氮化鈉或硫柳汞防腐,並再加入氯化鈉,使其最後含量為75％,充分混合,即成 1 %～15％瓊脂凝膠,趁熱分裝於平皿中,直徑10cm的平皿裝10ml,5mm平皿裝6ml,瓊脂凝膠的 厚 度為03～04mm。待瓊脂凝固後,用打孔器打孔,孔徑為05mm,孔間距為04mm。置37℃ 溫箱中孵育24小時後應用。如係優質瓊脂粉,則可直接用75％NaCl溶液配製成1％瓊脂。待檢材料(抗原)為從水皰中吸取的淋巴液,或者采取水皰皮或其它含毒組織以PBS研磨成1∶1 0乳劑,置4℃浸出24小時,3000r／min離心沉澱10分鍾後吸取上清液檢查。細胞培養毒可直接 用作待檢抗原。於中央孔內滴加待檢抗原,周圍孔內滴加各型標準陽性血清,均添加至孔滿為止,再置25～30 ℃溫箱中孵育過夜,次日每隔4～6小時觀察一次。在抗原孔與血清孔之間出現灰白色沉澱線 者為陽性反應。沉澱線大多偏近抗原孔。通常有兩條明顯的沉澱線,靠近抗原孔的一條粗而 長,呈孤形,靠近抗體孔的一條短直而細。但有時出現一條渾濁而粗短的沉澱線,這是 兩條線重疊的結果。如果中間孔中注加待檢血清,而在周圍孔中注加各型標準抗原,即可檢 測抗體的型。

③ 交叉免疫保護試驗 以待鑒定的病毒材料接種牛或 豚鼠等動物,待其 發病痊愈後再用已知型病毒攻擊,根據保護情況,鑒定病毒的型。牛在舌麵接種,豚鼠在後肢 蹠部接種。經14～21天待動物發病痊愈後,將其分成幾組,每組至少二頭,再用已知O、A、C等 型病毒分別攻擊,接種部位及方法同上。每組另設對照二頭。經攻毒後觀察7天,如“O”型組 的兩頭不發病,而對照動物和“A”、C型組均發病,即可認為待鑒定材料中含有“O”型病毒 。也可應用乳鼠進行交叉保護試驗,即取乳鼠3窩各10隻。3窩分別注射O、A、C型標準血清,6 ～24小時後,以待鑒定病毒材料攻毒。根據保護結果,判定毒型,具體方法參閱本書豬水皰病 病毒“診斷”節。

④ 中和試驗 應用A、O、C型的標準血清,與待鑒 定病毒懸液混合並感作 後,接種乳鼠或敏感細胞培養物。具體操作方法請參閱本書第十四章有關節段。

⑤ 酶聯吸 附試驗 (ELISA)近年來,ELISA已在口蹄疫的診斷中逐步代替補體結合試驗以及 中和試驗。 檢測田間樣品時,ELISA的敏感性高於補體結合試驗;對於含毒量較高的樣品,例如新鮮的水皰 皮和細胞培養物,可在2～4小時內獲得結果。應用預先在實驗室內包被的免疫反應板以及凍 幹劑,將更便於現場檢測。根據檢測目的的不同,可用雙抗體夾心法及其變法進行病毒抗原 的檢出,也可應用阻斷夾心法等測定血清中的病毒抗體。英國Pirbright實驗室應用免疫牛群 血清,對田間分離毒株與參考毒株進行比較研究,可以迅速確定流行毒株的型和亞型,乃至發 現 新的具有獨特抗原性差異的毒株,從而能在最短時期內選定參考毒株或新分離毒株製造相應 的滅活疫苗。有關ELISA的具體操作技術,請參閱本書第十四章。