病毒蛋白與功能

鼻病毒和腸道病毒在病毒粒子的形態結構和化學組成上十分相似。但是兩者在氯化銫密度梯度中的浮密度有著比較明顯的差別，鼻病毒的浮密度為138～156,而腸道病毒隻有133～144。這可能是由於不同的衣殼蛋白在結合銫離子以及對原先結合於病毒粒子上的陽離子進行交換的能力不同。  表16-3 口蹄疫病毒、鼻病毒和腸道病毒的某些理化學特性    病 毒 屬 病 毒 氯化銫中的浮密度 耐酸性 直 徑(nm) 殼 粒或亞單位數 RNA(%) 口蹄疫病毒屬鼻病毒屬腸道病毒屬心病毒屬 口蹄疫病毒鼻病毒14脊髓灰質炎病毒腦心肌炎病毒 143138~141134134 不耐pH<7不耐pH<7耐pH3~10耐pH3~10 23~25232724 60606060 3153029315  小RNA病毒沒有必需脂質,故對乙醚、氯仿和膽鹽等有機溶劑具有極大抵抗力。腸道病毒還有明顯的耐酸和抵抗蛋白水解酶的特性,但鼻病毒和口蹄疫病毒對酸敏感。病毒的許多理化學和生物學特性都與病毒蛋白有關,因此有必要對病毒蛋白進行深入研究。病毒衣殼蛋白至少有4種功能:1.保護病毒RNA不被環境中的RNA酶水解;2.識別由宿主細胞編碼的位於細胞膜上的病毒受體;3.決定宿主範圍;4.感染的組織特異性。此外,衣殼蛋白還具有特異的抗原性,以及將病毒RNA包裝進入衣殼和將病毒RNA釋放到宿主胞漿中的能力。口蹄疫病毒VP1蛋白不僅是主要的抗原,並且含有病毒受體結合區。用人工合成多肽證明主要的抗原決定簇位點在141～160號氨基酸殘基上,細胞膜受體結合位點在203～213號氨基酸殘基上。但是有人認為145～147號氨基酸(精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸,RGD)是細胞吸附位點。美國梅島動物疾病研究中心的科學家們最近(1994)發現,RGD序列內發生改變的RNA轉染BHK細胞後產生的非感染性病毒粒子不能吸附和感染BHK細胞。Rieder等人發現口蹄疫病毒VP1中132～159號氨基酸殘基形成一個G-H環,並暴露於病毒衣殼蛋白的外側。用C型和O型同源序列取代A型的G-H環序列,轉化細胞產生新病毒,單克隆抗體鑒定為O/A和C/A。Brown等人在pH64條件下篩選變異株,發現口蹄疫病毒抗酸株(AR株)形成的蝕斑明顯小於野生株,在BHK細胞中複製速度明顯減慢,毒力下降100倍。電子顯微鏡觀察病毒粒子比野生型小20%。等電聚焦電泳顯示VP1與野生型明顯不同。因此VP1可能與病毒的耐酸性有關。這一結果與我們較早在腸道病毒與口蹄疫病毒重組研究中的發現相類似。試驗證明,VP1含有5個β片層結構,VP2、VP3含3個β片層結構,VP1、2、3均含2個α螺旋結構。與β片層結構相連的環形結構位於殼粒表麵,所以環形結構在免疫學中占重要地位。VP1、2、3的C端位於殼粒外側,N端位於內側。這些末端可以自身或與其它蛋白末端結合(包括與VP4結合),使病毒殼粒結構更加穩定。VP4存在於衣殼內部。P2和P3區的蛋白主要參與蛋白質的加工及病毒RNA複製。小RNA病毒RNA5末端不含有一般宿主細胞mRNA的“帽”結構,但在5末端第一個堿基上以共價鍵與VPg上的酪氨酸殘基結合。實驗發現病毒RNA複製過程中正負鏈5末端都含有VPg,VPg可能在複製過程中起“引物蛋白”(primerprotein)作用。這種特殊的RNA複製方式與宿主mRNA轉錄不同,因此當宿主蛋白質和RNA合成受到抑製時,並不影響病毒RNA的合成。哺乳動物細胞蛋白質翻譯過程中需要起始因子eIF-4F,該因子中最大的一個蛋白稱為P220。在病毒感染早期,P220被水解成小肽,使宿主翻譯因子失活。2A蛋白酶參與P1、P2之間的Gln-Gly水解反應,同時還發現鼻病毒和腸道病毒的2A基因編碼蛋白參與P220的水解反應,而口蹄疫病毒則由引導蛋白L參與這一反應。由於宿主蛋白和RNA合成受到抑製,因此往往在感染後4小時,宿主DNA合成就受到抑製。有趣的是,小RNA病毒的2A和L蛋白隻能水解P220,從而抑製帶有5帽結構的mRNA轉錄,而不能水解病毒的3D蛋白,因此不影響病毒RNA的複製。

甲型肝炎病毒(HAV)在培養細胞中複製極慢(需5～7天),Minghelli-Schmitt(1993)等人用甲型肝炎病毒和脊髓灰質炎病毒的cDNA進行體外內切酶水解重組,將甲型肝炎病毒1～3214堿基片段與脊髓灰質炎病毒3302-5末端連接。用重組質粒轉化COS 1細胞,合成新的重組病毒粒子。重組病毒隻需3天就可以產生明顯的細胞病變,同時可以被抗HAV血清中和。甲型肝炎病毒1～3214堿基編碼衣殼蛋白,脊髓灰質炎病毒2A蛋白參與抑製宿主蛋白質翻譯,因此重組株既具有甲型肝炎病毒的抗原性,又具有較強的感染能力。由於宿主細胞不能提供小RNA病毒RNA複製所需的所有因子,所以病毒感染後首先合成自身RNA複製的必需因子。感染後10～15分鍾,病毒編碼的多聚蛋白開始合成。首先由2A蛋白酶將多聚蛋白水解成P1和P2+P3,3C蛋白酶再將P2和P3分別水解成單體—2A、2B和2C以及3A、3B、3C和3D。3D為RNA依賴的RNA聚合酶,參與病毒RNA的複製。在無細胞體係中,用正鏈RNA為模板合成病毒負鏈RNA,證明病毒RNA複製至少需要3種蛋白質,即病毒蛋白3D、VPg和分子量為67000Da的宿主蛋白HP。VPg含有VPgpUpU結構,因此可以做為引物與正鏈RNA3末端的Poly(A)結合,再由病毒蛋白3D沿正鏈模板合成負鏈RNA。2B和2C蛋白也可能參與病毒RNA的複製。

位於衣殼表麵突出的氨基酸多與抗體結合有關,稱為中和抗體結合區,又稱NIm(Neutralizingimmunogen)。鼻病毒的4個NIm區分別稱為NImⅠA(位於VP1)、NImⅠB(位於VP2)、NImⅡ(位於VP2)和NImⅢ(位於VP3)。這些NIm區分散於亞單位的不同部位,為突出於表麵的環。根據每個免疫原與周圍氨基酸的關係,可以將其分為兩部分:一部分為環突部,其氨基酸不與周圍氨基酸直接接觸;另一部分為環交部,其氨基酸直接與鄰近氨基酸接觸。以NImⅡ的主環為例,VP2氨基酸第153～155(GID)和164～166(GPV)為環交部,而156～163(LSSANEVG)為環突部。環突部為抗體結合部位,環交部起著維持環突部空間構型的作用。