一、準備工作
準備工作的內容包括器皿的清洗、幹燥與消毒,培養基與其他試劑的配製、分裝及滅菌,無菌室或超淨台的清潔與消毒,培養箱及其他儀器的檢查與調試,具體內容可參閱有關文獻。
二、取材
在無菌環境下從機體取出某種組織細胞(視實驗目的而定),經過一定的處理(如消化分散細胞、分離等)後接入培養器血中,這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培養稱為原代培養。
理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用於培養,實際上幼體組織(尤其是胚胎組織)比成年個體的組織容易培養,分化程度低的組織比分化高的容易培養,腫瘤組織比正常組織容易培養。取材後應立即處理,盡快培養,因故不能馬上培養時,可將組織塊切成黃豆般大的小塊,置4℃的培養液中保存。取組織時應嚴格保持無菌,同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌,為減少汙染可用抗菌素處理。
三、培養
將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養。如係組織塊培養,則直接將組織塊接入培養器皿底部,幾個小時後組織塊可貼牢在底部,再加入培養基。如係細胞培養,一般應在接入培養器皿之前進行細胞計數,按要求以一定的量(以每毫升細胞數表示)接入培養器皿並直接加入培養基。細胞進入培養器皿後,立即放入培養箱中,使細胞盡早進入生長狀態。
正在培養中的細胞應每隔一定時間觀察一次,觀察的內容包括細胞是否生長良好,形態是否正常,有無汙染,培養基的PH是否太酸或太堿(由酚紅指示劑指示),此外對培養溫度和CO2濃度也要定時檢查。
一般原代培養進入培養後有一段潛伏期(數小時到數十天不等),在潛伏期細胞一般不分裂,但可貼壁和遊走。過了潛伏期後細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底後要進行傳代培養,將一瓶中的細胞消化懸浮後分至兩到三瓶繼續培養。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細胞一般隻能傳幾十代,而轉化細胞係或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質,也可能僅有不死性(Immortality)而無惡性。
培養正在生長中的細胞是進行各種生物醫學實驗的良好材料。
四、凍存及複蘇
為了保存細胞,特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株,要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度-196℃,將細胞收集至凍存管中加入含保護劑(一般為二甲亞碸或甘油)的培養基,以一定的冷卻速度凍存,最終保存於液氮中。在極低的溫度下,細胞保存的時間幾乎是無限的。
複蘇一般采用快融方法,即從液氮中取出凍存管後,立即放入37℃水中,使之在一分鍾內迅速融解。然後將細胞轉入培養器皿中進行培養。
凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及複蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。
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