兔出血症病毒

兔出血症病毒(Rabbithemorrhagicdiseasevirus)

 兔出血症(RHD)是兔的一種急性高度接觸性傳染病。以呼吸係統出血，實質器官水腫、淤血及出血性變化為特征。本病於1984年初，首先在我國江蘇等地爆發，隨即蔓 延到全國多數地區。此後，世界上許多國家和地區也報道了本病。在我國確證兔出血症以後，歐洲進行了兔出血症病毒(RHDV)的病毒學和血清學回顧性調查，發現1982年保存的病料中即含有兔出血症病毒(RHDV)相關的病毒，他們還從保存了12～13年的血清樣本中檢出了相 關的病毒抗體，這說明該病毒在歐洲的兔群中已經存在了許多年 ，但當時歐洲的兔群中並沒有爆發RHD。鑒於中國在八十年代初期大量從西德引進長毛兔，1984年開始爆發RHD，有人推測，很有可能是隨 著生態環境的變化，使原來存在於歐洲但基本上無致病性的家兔或野兔杯狀病毒突 變成為RHDV而首先在中國出現，並引起疫病爆發。 圖17-2 兔出血症病毒的形態結構

理化學特性 RHDV在氯化銫中的浮密度為129～134g/cm ３，沉降係數為85～162S。對乙醚、氯仿和pH3有抵抗力，能夠耐受50℃1小時的處理。 RHDV含有一條單股正鏈RNA，由7437個核苷酸組成，分子量為24×10６～26×10 6，5’末端沒有帽狀結構，而代之以與感染性相關的VPg蛋白，3’末端具有一個短的P oly(A)尾。RNA基因組含有兩個開放閱讀框架(ORF)，5’末端的ORF編碼一個23 44氨基酸的多聚蛋白前體。該前體被病毒蛋白酶進一步分解為衣殼蛋白和非結構蛋白，其中衣殼蛋白的分子量為65kDa，該ORF相當於其它杯狀病 毒的ORF1和ORF2(見圖17-1)。3’末端含有一個開放閱讀框架(ORF),可能編碼一 個小的蛋白。除基因組RNA外，病毒顆粒中還含有22kb的亞基因組mRNA,它轉錄自基因組衣殼蛋白基因3’末端，編碼衣殼蛋白。最近(1995)，比較RHDV基因組5’末端的460 個核苷酸發現，分離自埃及、法國、德國、西班牙的多株RHDV，其差異僅有13%～34%， 說明RHDV自出現以來，尚未發生大的變異。

3.血凝性兔出血症病毒與其它杯狀病毒相比，最顯著的特點是具有血凝性，RHDV能夠凝集人類的各型紅細胞，肝病料中的病毒血凝效價可達10×220，平均為10×2１４；RHDV也凝集綿羊、雞、鵝的紅細胞，但凝集能力較弱；不凝集其它動物的紅細 胞。紅細胞凝集試驗(HA)在pH45～78的範圍內穩定，最適pH為60～72；如pH低於4 4，則會導致溶血；pH高於8.5，吸附在紅細胞上的病毒將被釋放。該吸附釋放現象可用於RHDV的提純。血凝素對氯仿、乙醚、受體破壞酶(RDE)、過碘酸鉀不敏感，甲醛因滅活病毒而使HA效價下降，胰酶、硼氫化鈉、氯胺T等則可使血凝素的活性完全喪失。

4.抗原性HI試驗、瓊脂擴散試驗、ELISA和中和試驗證實，世界範圍內的RHDV均為同一 血清型。歐洲野兔綜合症病毒(EBHS)與RHDV抗原性相關，但血清型不同，前者的抗血清不能 抑製RHDV的血凝作用，用RHDV特異性單克隆抗體或高免血清作ELISA、免疫電鏡、免疫印跡 可將二者區分開來，動物交叉保護試驗和傳遞試驗也顯示二者之間有較大的差異。

5.增殖兔出血症病毒不能在雞胚上增殖，也難於在各種原代或傳代細胞中穩定增殖，至今尚未真正找到一種能夠使其長期傳代的細胞。吉傳義等報道，該病毒至少可在兔 腎傳代細胞上增殖10代，傳至第3代以後，細胞開始出現規律性的病變，於接種病毒後24～ ７２小時內，大量細胞變圓、凝聚和脫落，但從傳代後的病毒接種培養物中，隻能檢測到很低的血凝價，甚至沒有血凝性。蕭慶麟等報道，RHDV接種Vero細胞和MA104細胞均可產生細 胞病變，在Vero細胞上的細胞病變表現為細胞萎縮、部分變圓和脫落，但傳至第三代以後，病變消失。羅經等報道，RHDV同步接種乳兔腎(RK)細胞或乳兔肺(RL)細胞48～72小時後，產生細胞病變，並能觀察到特異性熒光。這些結果都有待於進一步證實。

6.病原性引進的純種兔和雜交兔比我國本地兔易感，毛用兔比肉用兔易感。在自然條件下 ，RHDV隻感染年齡較大的家兔，2月齡以下的仔兔自然感染時一般不發病，人工感染3～5日 齡初生兔，即使大劑量攻毒亦不發病。未發現野兔自然感染造成的大批死亡，人工感染野兔不發病 ，但可產生低滴度的特異性血凝抑製抗體(1∶5～1∶40)。其它動物均無易感性。病死兔 的內 髒、肌肉、皮毛、排泄物、分泄物均可帶毒，可通過直接接觸而傳播，也可以通過被汙染的飼料、飲水、籠具以及剪毛、醫療器械和人員來往而間接傳播。消化道、呼吸道、生殖道及 損傷的皮膚均可成為病毒侵入途徑。人工感染的潛伏期為16～７２小時，自然病例的潛伏期為2～３天。最急性病例多見於新疫 區及流行初期，一般無任何前驅症狀，死前數小時突然倒地，呈昏迷狀態，臨終時表現出短暫的興奮，而後掙紮、抽搐，尖叫幾聲後猝死，典型病例可見鼻孔中流出鮮血。急性病例體 溫升高至405～４１℃或更高，精神萎頓，皮毛鬆亂，食欲廢絕，呼吸迫促，瀕死期全身 癱瘓，橫臥不起，反射消失，一般在症狀出現後6～8小時內死亡，孕兔會發生流產 。溫和型病例僅出現輕度體溫反應，精神不振，食欲減少和呼吸加快等，除非仔細觀察很難發覺，病程4～5天，一般不死亡。這類病兔可帶毒和排毒，是很危險的傳染源。兔出血症的病變特點是各組織器官彌漫性的點狀出血和實質器官的淤血、水腫和變性 。鼻腔、喉和氣管粘膜彌漫性充血、出血，氣管內充滿大量血染泡沫；肺髒上有數量不等大小不一的出血斑、出血點，並有水腫；心髒擴張、淤血，心包積液；心包膜點狀出血；肝髒 腫大，呈土黃色或淡黃色，水腫，質脆；脾髒淤血，腫大，腎髒淤血，呈暗紫色；十二指指腸粘膜、回腸粘膜、內分沁腺、性腺、輸卵管和腦膜亦可見充血和出血。組織 學檢查可見肝、肺、心、延髓等重要組織器官的微血管形成彌漫性血 管內凝血，間質水腫，實質細胞廣泛變性和壞死。但澳大利亞的學者報道，當地出血症死亡兔可能看不到出血，他們認為出血不是本病的一個 突出特征。 用HA法和ELISA法檢測人工感染家兔，發現病毒主要存在於肝髒，臨死前才進入血液。死 亡兔各髒器中的病毒含量由高至低依次為肝髒、血液、脾髒和肺髒，而腎、胸腺、心肌、腦、腸和骨骼肌的病毒含量很低。用免疫熒光和免疫膠體金法證明，RHDV主要定位於感染細胞 的胞漿，感染後期，隨著細胞壞死而進入細胞核內。[BT4]7.免疫人工攻毒致死的家兔，經肝、脾等髒器經研磨成勻漿後，可甲醛或其它僅化學劑將病毒滅活 ，即為滅活疫苗，滅活疫苗具有良好的免疫效果，一般在接種後6～8天產生HI抗體，16～18 天HI 抗體滴度可達211以上，以後緩慢下降。鋁膠苗的免疫期可達8～１０個月，油佐劑 疫苗的免疫期可達1年以上。滅活疫苗誘生幹擾素的能力也很強，在注射油佐劑滅活疫苗後1 8小時，誘生的幹擾素達高峰，血清中的幹擾素效價在1∶200以上，疫苗的早期抗病毒作用 主要是通過幹擾素發揮的。幹擾素誘 生劑PolyI:C誘生的高水平幹擾素亦有很強的抗RHDV能力，曾有報道，注射polyI:C6小時， 誘生的幹擾素達到高峰，12小時後下降。10小時時用強毒攻擊，試驗兔100%被保護。被動免疫也有良好的預防和治療作用，肌肉注射高免血清02ml即可抵抗強毒攻擊。發病後 體溫升高時，立即用1ml高免血清治療，大部分病兔可被治愈。[BT4]8.診斷兔出血症大多數為最急性型和急性型，發病後精神沉鬱，呼吸困難，很快死亡。 剖檢可見死兔營養良好，全身血液循環障礙，實質器官充血、出血，根據這些特點可作出初步診斷。確診則需經實驗室檢查。

(1)血凝(HA)和血凝抑製(HI)試驗微量法和玻板法均可。多數人習慣使用人的“O”型 紅細胞，但據楊漢春等報道，使用人的不同血型新鮮紅細胞所得結果無明顯差異。亦可將人的紅細胞通過高錳酸鉀固定後使用，此時HA或HI反應需在4℃進行，因為在22℃和37 ℃反應時，固定的紅細胞易自凝。血凝試驗(HA)用於檢出病、死兔 體內的病毒。病、死兔的肝髒或脾髒，研磨後加生理鹽水製成1∶5～1∶10的懸液，可以直接用於本試驗，具體操作方法參見本書第十四章。在本病流行初期，這些病料中的病毒血凝 效價可達10×213～10×218。玻板法用於現場檢疫，快速而簡便，5分鍾即可得到 結果。出口的兔肉勻漿，凍融後用PEG濃縮50～100倍，離心取上清即可能用於兔肉中是否帶毒的檢測。HA試驗得到的結果應通過HI試驗確證。HI試驗的特異性及敏感性都 很高，可用於 流行病學調查和疫苗免疫效果檢測，這種情況下多采用β法血凝抑製試驗術式；也可用於可疑病毒的血清學鑒定，此時多采用α術式，當陽性血清能降低被檢病料血凝效價2個滴度以 上時，即為陽性。

(2)間接血凝試驗(IHA)楊漢春用純化病毒，以戊二醛醛化綿羊紅細胞為載體，建立了間接血凝試驗，用以檢測抗體效價。其敏感性比HI高32倍，比AGP高1024倍。間接血凝抗原製備的最適條件：抗原濃度為1 5μg/ml,在37℃致敏1小時，最適反應溫度為37℃45min。

(3)瓊脂擴散試驗(AGP)矯正德等用病死兔肝髒乳劑製備的凍融抗原對感染病毒的兔血清進行本試驗，檢出了沉澱抗體；戴康等發現以甲醛滅活製備的抗原與抗血清反應時，粗 提抗原可出現2～3條沉澱帶，高度提純的抗原則隻出現一條帶。

(4)酶標抗體技術王啟明等采用雙抗體夾心法ELISA試驗快速診斷本病，結果與血凝試驗 具有良好的相關性，敏感性差別不大；潘榮生等應用雙抗體夾心法檢測冷凍兔肉產品中的RH DV，並與HAHI試驗對比，發現二者的敏感性相近，檢測骨髓樣品時的符合率為977%，檢 測肌肉樣品時的符合率為809%。酶標抗體染色法快速診斷本病的效果也很好：取病 死兔的肝髒或脾髒，觸片或製作冰凍切片，按常規法進行固定，與抗血清和酶標抗體反應，在顯微鏡下觀察到特異性的感染細胞即可作出診斷。