變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)能 夠清晰地分辨僅差別1個堿基的單鏈寡聚核苷酸。核酸序列測定技術就是在這種高分辨率變性PAGE技術的基礎上建立起來的。目前有二種快速的DNA測序方法:酶促法和化學降解法。雖 然其原理大相徑庭,但它們都需要使待測DNA片段轉變成一係列標記的單鏈寡聚核苷酸,這一 係列寡聚核苷酸均有一個固定的5末端(起始端),但3末端(終止端)長度不同，形成一係列隻相差1個核苷酸堿基的連續末端。它們是通過分別終止於DNA鏈上不同位置的A、T、C和G 堿基這4種反應體係來製備的。這4種反應生成的單鏈寡聚核苷酸。在變性PAGE中上樣於相鄰 的加樣孔，電泳後就可以讀出被測DNA鏈的堿基組成順序了。下麵主要介紹酶促測序法，也就是常用的雙脫氧末端終止法。其原理類似於DNA聚合酶合成和延伸DNA鏈的過程，隻要在新的DNA鏈合成過程中，加入一種特殊的底物 雙脫氧核糖核苷酸(ddNTP)，它的5 端能正常連接到上一個核苷酸的3端，形成磷酸二酯鏈，但它的3端羥基因脫氧而不存在 ，所以不能與下一個核苷酸的5端形成磷酸二酯鍵連接。當正常DNA合成過程中，摻入這種 ddNTP，新DNA鏈的延伸也就終止於此。因而在4種反應體係中，分別加入4種不同的雙脫氧核 苷酸，即ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP。由於ddNTP是隨機摻入的，於是4種反應體係中，新 DNA鏈的延伸可隨機終止於任何位置的A，T、G或C堿基，最後得到一係列僅差一個堿基的單 鏈寡聚核苷酸。雙脫氧末端終止法的主要步驟包括： 1、模板DNA製備 通常將待測病毒DNA或cDNA片段(病毒RNA的反轉錄產物)重組到M13噬菌體或高拷貝質粒，如pUC係列等，獲得病毒核酸片段的克隆。或者用PCR大量擴增待測片段。然後采用堿變性法將雙鏈DNA變性為單鏈DNA模板； 2、退火反應 加入人工合成的引物 ，與模板DNA待測區域退火； 3、延伸標記反應 加入4種dNTP，其中一種 為放射性同位素標記的dNTP,常用α 32P dATP或α 32 P dCTP(如果引物5末端已預先標記，則不用)和DNA聚合酶，常用T7測序酶和 Taq DNA聚合酶(作者經驗表明，前者的測序效果 更佳)，延伸標記大約5分鍾； 4、延伸終止 將延伸標記物等 分4份，分別加入最適濃度的4種ddNTP，使延伸反應能夠終止於所有可能發生的位置； 5、終 止反應 加入上樣液終止上述反應，95～100℃變性3分鍾，這樣就產生出一係列大小 的放射性標記的單鏈寡聚核苷酸； 6、電泳分離 將4種反應產物上樣於變性PAGE的相鄰上樣孔，用1 300～1 800V的高壓進行電泳分離，然後放射自顯影顯現寡核苷 酸條帶，最後直接讀出所測定的序列。目前測序反應已標準化，許多生化試劑公司均有標準化的測序試劑盒銷售，具體操作方法可按試劑盒的操作手冊進行。一般24小時左右可完成 一次序列測定。DNA序列測定為深入研究基因的結構與功能奠定了基礎，通過測序分析病 毒核酸的一級結構,對於了解病毒的結構和功能、病毒的複製、病毒的遺傳與變異等有特別 重要的意義。測序是區別二種不同核酸分子最精確的方法，雖然把這一技術用於病毒診斷的 條件尚不成熟，但隨著測序技術的進一步發展和自動化，它有可能成為鑒別和診斷病毒的最佳方法之一。
上一篇：病毒基因組的限製性內切酶圖譜和寡核苷酸指紋圖
下一篇：杯狀病毒科
