病毒核酸是人們已知的生物 遺傳物質中最為簡單的一種,因此病毒學家有可能比較深入地研究病毒的基因結構,這也是病 毒遺傳學進展快於遺傳學其它領域的原因之一。例如,目前人們已經測定了幾百種病毒的 全基因序列,而在細菌中僅完成了大腸杆菌( E.coli )的全基因測序 。因此很多生物學家希望通過對病毒遺傳學的研究了解生命的某些規律,以應用於包括人類 在內的其它生物遺傳學研究。 (一) 病毒基因組的限製性內切酶圖譜病毒基因組核酸的 堿基數在3～300kb之間。300kb以下的病毒DNA經內切酶水解,進行瓊脂糖凝膠電泳染色後,可 以觀察到清晰的DNA帶,而其它生物染色體DNA水解後隻能看到彌散的DNA帶。由於病毒核酸的 這一特性,使人們可以製備準確的病毒基因組核酸酶切圖譜,利用不同的內切酶切割病毒DNA, 依據切割後的片段在凝膠電泳中泳動速率不同所形成的電泳帶型做出診斷。如單純皰疹I型與II型的鑒別以及肉食獸細小病毒的鑒別診斷等。病毒基因組的限製性內切酶圖譜,或稱物理圖譜,是指描繪病毒雙鏈DNA上各種不同限製性內切酶的酶切位點分布情況、限製性片段大小及其排列順序的圖譜。準確的內切酶圖譜是將病毒的全部DNA序列輸入電腦,用特別的軟件係統(如DNA star)判讀序列,由電腦繪出所有已知內切酶的酶切位點。如果尚未測定某種 病毒DNA的全部序列,則需用部分消化法(partial digestion)逐一測定不同內切酶的位點。下麵簡要介紹部分消化法繪製內切酶圖譜。繪製內切酶圖譜,必須采用病毒的線狀雙鏈DNA ,進行各種內切酶的部分消化。對於單鏈DNA病毒要提取其複製過程中的雙鏈中間型;部分單 鏈的病毒DNA,需要有DNA聚合酶Klenow片段補成雙鏈;對於RNA病毒目前尚沒有商品化的RNA限 製性內切酶(Ribozyme除外)可用於製備病毒RNA的酶切圖譜,因此所謂RNA病毒的酶切圖譜,實 際上是病毒RNA製備的cDNA酶切圖譜。通常先將病毒cDNA克隆到質粒上,利用質粒上已知的酶 切位點進行末端標記,分離一端標記片段進行部分水解測定,得到酶切圖譜。如果病毒DNA是 環 狀,則必須用隻有一個切割位點的內切酶將環狀DNA切成線狀DNA。通常提純的病毒DNA量很少 ,要用同位素32P末端標記法標記後再進行部分酶切分析,分析方法簡述如下:(1)用末端標記法,對線性化病毒DNA的2個5末端進行同位素標記,通常用γ 32PdNTP進行標記;(2)選擇一種在病毒DNA上隻有一個酶切位點的內切酶,將標記的 病毒DNA切割成左、右兩段;(3)瓊脂糖電泳分離標記的左、右兩個片段,這兩個片段均為 一端32P標記DNA;(4)將一種內切酶按正常工作濃度稀釋10、100和1 000倍,按常規方法酶切標記的左端DNA片段,電泳後放射自顯影,以決定部分消化的最適酶工作濃度和時間; (5)部分水解可以產生多種不同的DNA片段,計算放射自顯影片段的分子量,即可標出所用內 切酶的切點在左端DNA片段上的位置;(6)同樣的酶切測定右端標記片段;(7)用其它內 切酶進行同樣的實驗,以測定其切點的位置。這種方法測定的內切酶圖譜精確度在 01～05 kb之間,如果在01kb的DNA片段中有兩個以上相同的酶切位點,則需用DNA序列 分析 法測定準確的位點。 (二) 病毒寡核苷酸指紋圖(Oligonucleotide fi ngerprinting) 目前已經發現數百個血清型的RNA病毒,此外還發現由於病毒基因 組在不斷進化過程中所產生的越來越多的亞型和變異株。對同一病毒不同毒株的比較以及抗原性相似而基因結構有差別的病毒之間的鑒別診斷,如口蹄疫病毒和流感病毒等抗原變異分 析,狂犬病毒和脊髓灰質炎病毒等疫苗株與野毒株的鑒別等,應用常規的血清學方法(如中和 、瓊擴、補反和血凝抑製等試驗)往往難以奏效。然而應用寡核苷酸指紋圖分析,就能容易地 區別這些即使 基因組核苷酸序列隻有微小差異而遺傳關係十分接近的RNA病毒株。通過比較同一血清型不同毒株的RNA指紋圖就能鑒別這些毒株在遺傳上的遠近關係或在進化上的先後順序,研究流行毒株的起源及其擴散的去向,毒株的變異規律及突變機率以及監控疫苗株的遺傳穩定性等。 此外 ,寡核苷酸指紋圖還可用於:①研究RNA病毒基因組結構的複雜程度,例如是否含有重複序列; ② 分析分節段的病毒基因組RNA;③鑒定RNA病毒基因組的重組或重排;④繪製RNA病毒的基因圖 譜;⑤分析缺失幹擾病毒RNA的種類和產生機製;⑥鑒定病毒mRNA的種類。寡核苷酸指紋圖的基本原理是用一種核酸酶對純化的病毒RNA(同位素標記)進行消化。通常使用核糖核酸酶T 1(RNase T1),此酶特異作用於鳥嘌呤核苷酸(G)3端磷酸,並專一切割與相鄰核苷酸相連 的磷酸二酯鍵,產生3末端帶G的寡核苷酸。所產生的寡核苷酸片段通過雙相電泳分離後,進 行放射自顯影,每一種寡核苷酸片段就出現象指紋一樣的圖譜。由於病毒不同,其基 因組的大小、G的含量和分布均不相同,所以T1酶消化後就會產生許多理化特性和大小不盡相同的寡核苷酸片段。經聚丙烯酰胺凝膠雙相電泳和放射自顯影後就會在X光片上出現不 同的寡核苷酸指紋圖型。其基本方法如下: 1、病毒RNA製備 病毒RNA通常從梯度離心純化的病毒粒子中提取,以確保RNA的純度; 2、RNA的酶切消化 通常用RNase T1消化,以獲得較大的寡核苷酸片段。病毒RNA加入載體tRNA至總量1 00μg,乙醇沉澱,懸浮於10μl 20 mmol／L Tris•HCl, pH74,2 mmol／L EDTA緩衝液。加入10單位T1酶,100℃變性90秒,冰浴,再加入10單位T1酶,37℃消化30分鍾,加入尿素至6m ol／L,加入8μl上樣液(6mol／L尿素,50％蔗糖,02％二甲苯蘭FF,02％溴酚蘭,15mg／ml 酵母tRNA),電泳前65℃處理3分鍾; 3、RNA標記 標記物為放射性同位素, 有二種標記方法:(1)體內標記法,通常在病毒培養液中(最好用不含磷的培養基)加入01 ～1mCi／ml 32 P的磷酸鹽,在病毒增殖過程中,隨核酸的合成而標記病毒RNA。此外, 也可在培養基中加入3H標記的核苷酸(如鳥嘌呤核苷酸),對病毒RNA進行標記。(2)體外 標記法,純化的病毒RNA用T1酶消化,然後用(γ32P)ATP對寡核苷酸片段的5進行 末端標記,酚／仿抽提,乙醇沉澱後即可進行雙向電泳和放射自顯影。 4、雙相電 泳 雙相電泳是利用核酸分子之間因堿基組成不同而存在的電荷差異和分子大小不 同兩個物理性狀聯合對核酸分子進行分離,其分辨率比單相電泳更高。第一相電泳通常在pH3 5的酸性環境中進行,此時核酸分子因堿基組成不同,解離水平不一致,造成所帶電荷的差異 ,達到初步分離。第二相電泳改在pH中性或偏堿(pH83)的環境中進行,此時分離核酸分子主 要靠凝膠的分子篩作用,依核酸分子大小進行分離,而與核酸分子所帶電荷無關。在製作寡核 苷酸指紋圖時,第一相電泳常用10％的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE),含6mol／L尿素,25mmol／L檸檬酸,pH35,於同樣濃度及pH值的檸檬酸緩衝液中預電泳1小時,然後上樣,900V電泳,溴酚蘭 泳至膠底部1cm處時可停止電泳,沿電泳方向切取每一孔樣品泳過的膠條,進行第二相電泳。 第二相電泳常用22％的PAGE,含01mol／L Tris硼酸,25mmol／L EDTA,pH83。製膠時, 將第 一相電泳後切取的膠條置於第二相電泳膠底部,然後於同樣的Tris硼酸緩衝液中從下往上電 泳。 5、放射自顯影 第二相電泳完畢後,幹膠,進行放射自顯影,最後分析比較指紋圖型。
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