細胞代謝的測定

2.細胞代謝的測定細胞在代謝過程中形成各種 酸類，使營養液的pH下降，而病毒感染的細胞由於代謝障礙，產酸能力降低，且因細胞破 壞，釋出堿性成分，營養液的pH下降不明顯。根據這一原理，應用比色法測定感染培養物與 對照培養物的pH差異，從而間接推測細胞培養物中有無病毒增殖。但是必須指出，這種測定 隻是“量”的差異,因此一定要細致準確。同時，無論是感染培養物，還是對照培養物，都 必 須多做幾個樣品，以免個別培養瓶中偶然因素所致的pH變化，引起錯誤判定。腺病毒感染 的細胞培養物是個例外，由於感染細胞的有絲分裂受阻，糖酵解增高，產酸量增加，因此感 染細胞培養物的pH經常低於未感染的對照細胞培養物。

〖BT4〗3.抗原的測定在病毒感 染的細胞 培養物中，通常都有特異性病毒抗原的出現。因此，應用相應的已知免疫血清測定細胞培養 物內的特異性抗原，是一個準確而特異的方法，不僅可以判定細胞培養物中有無病毒增殖 ，而且可以鑒定病毒的種類。測定病毒抗原，一般應用補體結合反應、沉澱反應(瓊脂擴散 試驗等)以及熒光抗體和酶標抗體檢查法等，後兩種方法還有確定病毒抗原在細胞內存在 部位，也就是抗原定位的功能。流感病毒、副流感病毒和細小病毒等含有血凝素，能夠凝 集某些動物的紅細胞。測定培養液中的血凝素，是判定這類病毒存在的常用方法。應用已知 的特異性免疫血清進行血凝抑製試驗，更可進而鑒定病毒的種類和型。某些病毒感染，例如 某些副流感病毒和痘病毒，可在細胞培養物中呈現紅細胞吸附現象。由於這種紅細胞吸附現 象的出現早於細胞病變，因此可以用作早期判定。通常是將紅細胞懸液加於細胞培養物中， 待其感作幾分鍾後，吸出紅細胞懸液，並用洗液稍稍衝洗一下細胞培養物。隨即置低倍顯微 鏡 下檢查，可見感染細胞周圍粘附有紅細胞。這種紅細胞吸附現象，也可被特異性免疫血清所 抑製。關於這些免疫血清學方法的詳細機理和操作步驟，將在本章後麵幾節中介紹。本 書第三篇“病毒學各論”在敘述各該病毒的鑒定方法時也將介紹這方麵的資料。

〖BT4〗 4.中和試驗應用已知的免疫血清，分別與感染培養物混合，感作一定時間後， 用以接種敏感細胞。 隨後檢查各管細胞培養物的細胞病變、血凝素或紅細胞吸附能力。能被某一已知免疫血清特 異地抑製的感染培養物，就是存在著相應病毒的證明。對未知病毒的鑒定，需要使用 多種不同種類的抗血清進行試驗，但根據待鑒定病毒可生長增殖的細胞種類、細胞病變 類型、疾病的流行情況和症狀等等，適當縮小試驗範圍，選 擇最為可能的相應抗血清進行鑒定。一般是用200 TCID50的病毒液(見下節)和抗血清 等量混合，充分振蕩混合後，置37℃放置一小時。對特別不耐熱的病毒，可置4℃冰箱內 進行感作，隨後接種細胞。通常應用4單位的抗血清(例 如將效價為1:1024的抗血清，作成256倍稀釋，即為4單位抗血清)，但對某些病毒， 可能要用高得多的抗血清(例如20～200單位的抗血清)才能呈現中和效應。因此最好將抗血 清作成4～200個單位的幾個稀釋度進行試驗，同時設置病毒、血清對照，以便排除抗血清對 細胞的毒性以及病毒本身不產生細胞病變等意外現象。每天檢查一次。當病毒對照管內的細 胞層完全變性脫落，而在加血清的試管中細胞不出現病變，繼續保持正常形態時，即 可認為引起細胞病變的病毒與所用抗血清是相應的。例如使用的是乙型腦炎抗血清，則即 可初步判定該病毒為乙型腦炎病毒或其近似的同屬成員。關於中和試驗的原理和詳細方法將 在本章下一節介紹。

〖BT4〗5.病毒間的幹擾現象兩種不同種類的病毒同時接種於一個培養容器時，其中一種病毒的增殖對另一種病毒的增殖 呈現明顯的抑製作用，這種現象即病毒間的幹擾現象。例如流感病毒能夠幹擾西方型馬腦炎 病毒的增 殖，而乙型腦炎病毒則可幹擾脊髓灰質炎病毒等。故在某一細胞培養物中同時加入接種物 以及可被幹擾的病毒，如果後者的增殖受到抑製，則就可以間接判定接種物中存在一種可以 幹擾後者的病毒。這一方法主要用於不產生細胞病變以及沒有血凝和紅細胞吸附特性的 病毒的鑒定。現以豬傳染性胃腸炎病毒幹擾牛病毒腹瀉粘膜病病毒為例，說明有關方法 ：先將疑似豬傳染性胃腸炎感染的病料同步接種於豬腎細胞，24小時後，接種100個TCID ５０的病毒性腹瀉粘膜病病毒，同時設病料組、牛病毒性腹瀉粘膜病病毒組、正常 細胞組對照，72～96小時後觀察，正常細胞沒有病變，病料牛病毒性腹瀉粘膜 病病毒組有病變，病料組細胞沒有病變，說明實驗條件成立，可進行判定。若接種病料的細 胞再經接種牛病毒性腹瀉粘膜病病毒產生細胞病變，則表明此病料中沒有豬傳染性胃腸炎 病毒在細胞上生長。若未產生細胞病變，則表明病料中含有豬傳染性胃腸炎病毒，且已 在細胞上生長。幹擾試驗陽性。 。

〖BT4〗6.電子顯微鏡觀察在電鏡日益普及的今天，取感染培養物作成電鏡標本後染 色檢查，是一個比較快速可靠的方法。電鏡不僅可以看到病毒粒子的存在，而且可以根據病 毒粒子的形態及其在細胞內的位置，而大致判定其屬於哪一個病毒科(屬)。我們在 病毒培養和病毒鑒定工作中經常應用電鏡手段，特別是對某些具有特征性形 態結構和排列方式的病毒，都取得了良好的效果。有關電子顯微鏡技術的原理和方法，請參 閱本書第十二章。