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層析法-病毒提純方法



錄入時間:2009-6-26 9:28:09 來源:青島betway必威西汉姆联

   病毒粒子表麵攜帶特定的電荷群,因此病毒對離子交換樹脂及類似的其它吸附劑具有親和性。利用吸附劑的層析法分為兩種,一種是正吸附法,即依據病毒粒子表麵所攜帶的電荷進行特異性吸附,然後用適當濃度的離子溶液將病毒粒子解離回收;另一種是負吸附法,即隻吸附組織或宿主細胞成份等非病毒蛋白,而讓病毒粒子通過。收集濾液後經差速離心沉澱法回收病毒。由於各種病毒的大小和表麵結構等理化性質不同,因此對吸附劑的親和性也有顯著的差異。
1.萄聚糖柱層析法將初步濃縮的材料,通過葡聚糖G150或G200柱層析,然後用002~015mol/L磷酸]鹽緩衝液(pH76)洗脫,分部收集,測定280nm波長處的OD值,將含病毒的各部分相混合,]再濃縮,透析之後,即可得到比較純淨的病毒,Nagano(1989年)用Sephacryls1000柱層析]純化了雞傳染性支氣管炎病毒。
 [BT4]2.凝膠層析法
①     磷酸鈣凝膠:這是病毒吸附層析法中較為常用的凝膠,由0.5mol/L]CaCl2和05mol/L]Na2HPO4溶液混合製備凝膠狀沉澱物。在中性條件下生成的凝膠稱為“brushite”,在]堿性條件下生成的凝膠稱為羥基磷灰石(hydroxypatite)。兩者均用0001mol/L磷酸鹽緩衝]液懸浮,置於4℃4~5天,使它充分沉澱後應用。
②氫氧化鋅凝膠:是由7mol/L氨水與01mol/L醋酸鋅溶液滴加混合(pH85)而製備的,在製備後數小時內較穩定,可作為吸附劑。Newton和Beris等將水泡性口炎病毒懸液與氫氧化鋅凝膠混合,使其形成複合體後沉澱,然後用008mol/L]EDTA(pH85)解離病毒,獲得較好的回收量。 
②     焦磷酸鎂凝膠:是由01mol/L焦磷酸鈉和01mol/L]MgCl2,以2:10(體積)比]例在室溫中緩慢滴加混合而獲得的較穩定的焦磷酸鎂凝膠。西村等將牛痘病毒懸液同此凝膠混合,使病毒吸附於凝膠,然後用01mol/L鹽水洗2次,最後用03mol/L枸櫞酸鈉溶液解離病毒,將病毒較好地回收於水相中。 
 3.離子交換纖維素柱層析法  離子交換層析適於分離幾乎所有帶電荷的分子。通常有陰離子交換劑和陽離子交換劑兩種,其主要特性見表13-1。[JZ][HT5”H]表13-1〓常用的離子交換纖維素的特性[HT6SS][]BG(!][BHDFG2,WK14ZQ,WK15ZQ,WK8ZQ,WK14W]種類[]活性基團[]性質[]作用[BHD][]二乙基氨基乙基[]強堿[][BHDWG1*3/4]陰離子交換纖維素[]氨基乙基[]中強堿[]吸附帶負電荷的物質[BH][]對氨基苄基[]弱堿[][BHD][]磺甲基[]強酸[][BHDW]陽離子交換纖維素[]磷酸[]中強酸[]吸附帶正電荷的物質[BH][]羧甲基[]弱酸[][BG)F][HT5SS]  某些病毒可以被離子交換劑經離子鍵作用而吸附,通過改變平衡液的離子強度,使其再]洗脫下來而達到純化目的。腺病毒和口蹄疫病毒被DEAE纖維素吸附,可分別再用05mol/L]和015mol/L]NaCl溶液洗脫下來,從而得以純化。  
4.親和層析法  親和層析是一種特殊的吸附層析,基質與待分離物具有特異的生物親和力。通常是將特]異的抗體經共價偶聯作用結合在配基上組成一種不溶性配基。當相應的抗原物質通過固定配]基裝成的層析柱時,即被吸附。隨後再改變實驗條件,將其洗脫下來,達到純化的目的。該法是於80年代初期開始用於病毒的分離提純,不僅純度好,敏感,而且回收率高。Njayou(1991年)應用此法成功地提純了麻疹病毒。他們應用猴抗麻疹病毒的IgG進行共價偶聯,獲得了高純度而有活性的病毒,回收率可達總回收成份的30%。Rimmelzwaan(1987年)應用犬細小病毒的中和性單克隆抗體親和層析,純化了細小病毒,經SDSPAGE]和ELISA鑒定,99%以上的雜蛋白被洗除,收獲了70%~90%的病毒抗原成份。

 

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