電鏡放射自顯影(electronmicroscopicradioautography)技術是電鏡技術與放射性自顯影技術相結合的一種新技術。它把靜態的形態學和動態的生理功能的研究有機地結合起來。其原理是在含有放射性物質的組織切片上，敷上一層感光核乳膠，經過一段時間後，從組織切片中放射出來的放射線使核乳膠中的溴化銀感光形成潛影，再經過顯影處理，使在組織切片中的放射性物質以銀粒的形式出現，通過肉眼、光鏡及電鏡觀察，研究該放射性物質在組織切片中的分布及其數量等。該法已成為現代生命科學研究中的重要方法之一，並已得出一些非常有價值的資料，如生物大分子核酸、蛋白質的合成和代謝研究，多糖類和脂肪的合成和轉移定位，分子雜交結果的鑒定，酶分子定位，標記抗體對抗原的定位，激素和藥物的合成部位，病毒感染細胞中病毒複製過程的定位，宿主細胞中病毒基因的示蹤以及感染和未感染細胞新陳代謝的比較等等。 電鏡放射自顯影的樣品製備程序： 放射性同位素標記[BH] ↓ 固定、包埋 ↓ 超薄切片 ↓ [] 鈾、鉛電子染色[][]噴碳膜(噴鍍儀內) ↓[][] ↓ 噴碳膜(噴鍍儀內)[][]敷乳膠膜(暗室內) ↓[][]↓ 敷乳膠膜(暗室內)[][]曝光(暗盒內4℃) ↓ [][] ↓ 曝光(暗盒內4℃) [][]顯影、定影(暗室內) ↓[][] ↓ 顯影、定影(暗室內)[] []鈾、鉛電子染色 [] [] ↓ 電鏡觀察 1.放射性同位素的標記 (1)放射性同位素的選擇：要考慮放射強度、半衰期以及使用劑量和曝光時間等因素。就β射線而言，能量低者比高者的感光效率高，分辨率也高，因此，如果其它條件相同，應盡量選用能量低的同位素。從感光效果、自顯影效率或分辨率考慮，選擇的順序是3H→14C→131I→32P。目前市售的大多數標記化合物都用3H來標記，它已成為該技術中最常用的同位素。 (2)放射性同位素標記化合物：包括研究DNA的有3H胸腺嘧啶核苷、3H放線菌素D；研究DNA的有3H尿嘧啶核苷；研究蛋白質的有脯氨酸、精氨酸、亮氨酸以及氚標記的氨基酸等。放射性標記化合物雖可貯存，但它會產生輻射自分解。如要貯存，最好稀釋至所需的放射強度和濃度，以減少自分解。而且須貯存在黑暗處，尤其對不穩定的化合物，要在-140℃下貯放。一般的可在2～4℃冰箱內存放幾個星期不變質。如需較長期貯存，最好放在-100℃條件下，並須加1～3％乙醇作穩定劑和抑菌劑。 (3)使用劑量與曝光時間：對於超薄切片，要獲得滿意的結果必須有足夠的劑量。與光鏡的自顯術相比，劑量要大得多，電鏡放射自顯影為37×105～37×107Bq/g(10～100μCi/g)體重，細胞培養液中的放射性同位素的含量為37×103～37×107Bq/g(01～100μCi/ml}。為了縮短曝光時間，可加大投與量5～10倍。投與量與曝光時間成反比。 (4)標記方法：常用的有：①注射法，按所需的劑量在一定部位注入體內，完畢後防止外流，可用2％火棉膠封口；②灌胃法，即向胃中引入標記物質；③澆灌飼喂法，用標記物質處理土壤，讓植物吸收，再用該植物飼喂動物；④塗抹法，將標記物質塗抹在動物體表，令其通過皮膚進入體內；⑤培養法，向組織細胞培養液中加入一定比強度的放射性同位素，混勻，在37℃下培養，培養時間隨材料而定。培養後用生理鹽水洗滌，低速離心(1000r/min)5～10分鍾，棄上清，初步洗去多餘的放射性物質。加生理鹽水重新懸浮，再離心，棄上清，將其沉澱塊修成不超過05mm為宜。 2.超薄切片 標記後的樣品，按常規法製備超薄切片。通常是按一定時間間隔陸續地取樣固定，以追蹤放射性同位素的轉運、代謝等變化過程。 3.乳膠膜的製備 用於電鏡放射自顯影的核乳膠的直徑，理論上是越小越好，以提高分辨率。但當溴化銀顆粒的直徑小於50nm時,其感光度顯著下降，所以通常使用的核乳膠的直徑在200nm以下。目前常用的國產乳膠有HW3、HW4；進口的有英國的HfordL4和日本的櫻花NRH2等。 核乳膠在常溫下為半固體，使用前在暗室紅燈下先將其融化稀釋。按1∶1、1∶2、1∶4或1∶6加入雙蒸水，置熱水浴中加熱到40℃，約15分鍾，充分混勻。核乳膠的濃度越大，製備的乳膠膜上的銀粒就越密。稀釋後的乳膠用帶膜的載網沾一下，待幹，用電鏡檢查銀粒是否重疊和留有空隙。合格後置於4℃冰箱中保存。最好是現用現配，否則本底增高，影響成像效果。製備單層乳膠膜常用方法： (1)套圈法: 用有機玻璃或金屬做一個與載網直徑相當的柱子。帶有切片的載網(切片朝上)置於柱子頂端。再用金或銀或鎳絲等做一個4mm直徑金屬環，燒結在玻棒上。將金屬環浸入乳膠中，垂直插入，輕輕提起，環內即形成一乳膠膜。再將膜輕輕地套在置於柱頂端帶切片的載網上。用鑷子把載網輕輕夾起，待幹後置於暗盒中自顯影。 (2)浸塗法: 取一載玻片，充分洗淨晾幹後，將一小塊雙麵膠紙貼在載玻片的三分之一處，把帶有切片的載網放在膠紙上，切片麵朝上，每張載玻片上可放2～4個載網。將載玻片慢慢浸入稀釋好的乳膠中，徐徐提起。用濾紙抹去載玻片背麵的乳膠，垂直地置於無塵處，待幹後放入暗盒中曝光。 4.曝光 切片中的射線與乳膠中的溴化銀粒子相互作用的過程稱為曝光或自顯影。通常在暗盒中進行，盒內相對濕度控製在45～50％。密封後置於4℃冰箱中。一般需幾周到幾個月。準確估計曝光的時間不太容易，通常每隔一定時間(約二周)取樣作顯影試驗，直到效果滿意時，就全部結束曝光。 5.顯影和定影 通過曝光後得到的結果隻能是潛影，必須經過顯影和定影後才能觀察。顯影劑最好使用微粒顯影劑，以獲得較高的分辨率。常用的有D19或D19b，顯影溫度為15～20℃，顯影時間為2～4分鍾。值得注意的是，因顯影劑對已形成潛影的銀粒和未形成潛影的溴化銀晶體都能發生作用，使其顯影，隻是前者速度快，後者速度慢。正確的顯影時間是前者剛好顯影清晰，後者還未顯影。如顯影時間不足，潛影不能充分顯示，時間太長，會形成霧點和人為的假象。定影是將未形成潛影的溴化銀晶體溶去，留下還原的銀顆粒。常用的定影液是柯達F5。 6.電子染色 為了增加自顯影樣品的反差也要進行電子染色。其方法與常規超薄切片相同，也是用鈾和鉛染色。電子染色這一步既可放在敷加乳膠之前“先染”，也可在顯、定影之後“後染”。先染的優點在於切片上沒敷乳膠層，所以在染色過程中不擔心引起銀粒移位和丟失。缺點是可能在染色中損失一些放射性物質。為了防止染液中的某些基團與乳膠發生作用，在染色後都需噴鍍一層碳膜後再敷加乳膠。後染的優點是能較好地保留切片中的放射性物質，缺點是容易產生染色沉澱物。 為了防止樣品中的四氧化鋨與乳膠顆粒作用導致潛影消退，通常在乳膠層與切片之間噴鍍一層碳膜。
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