免疫電鏡-電鏡樣品的特殊製備技術　

免疫電鏡技術是把免疫化學技術與電鏡技術有機地結合起來，使之兼有兩方麵的特性，所以是研究抗原抗體相互作用的一種方法。抗原抗體之間的相互作用是免疫化學反應的基礎，它具有高度的特異性，結合電鏡的高分辨能力和放大本領，可在超微結構和分子水平上研究各種組織和細胞內的免疫反應，並能精確定性、定位和半定量，使形態與機能緊密結合。　　目前免疫電鏡主要分為有標記物和無標記物兩大類。無標記物類的常用方法為抗原抗體直接作用後形成的免疫複合物的電鏡觀察。有標記物類，首先由Singer在1959年建立鐵蛋白(ferritin)標記抗體技術；由Nakane和Pierce在1968年建立酶標記抗體技術；由Faulk和Taylor在1971年建立膠體金標記技術。此外，還有雜交抗體技術(Hybridantibodymethod)和鐵蛋白抗鐵蛋白複合物技術(鐵蛋白抗體法)及凝集素(Lectin)電鏡標記技術等。　　 1.抗原抗體免疫複合物(液相免疫電鏡法)　　這種方法是用電鏡直接觀察抗原與抗體特異結合後形成的大分子複合物，具有簡單易行、抗原和抗體用量少、在短時間內即可得出結果等優點。可用於檢出病毒或進行病毒分型，並已用於臨床診斷。具體方法甚多，隻介紹常用的幾種。　　(1)離心法：①取含病毒的待檢樣品02ml、生理鹽水07ml和稀釋的已知抗血清01ml，充分混合。一般情況下可使用不作任何處理的抗血清。如將抗血清進行40000r/min1小時離心和56℃30分鍾滅活等處理，或使用純化的抗體球蛋白，更可獲得良好的電鏡圖像。對於一定量的抗原，所用抗體的濃度與形成的複合物有很大關係。抗體濃度太低或太高時，都不易形成大的抗原抗體複合物，所以要有適合的抗原、抗體比例。抗血清的稀釋可用倍倍稀釋法，也可用連續的10倍稀釋法。②置37℃感作1小時，然後4℃過夜。　　③10000～15000r/min離心30分鍾。　　④去上清，將沉澱懸浮在少量緩衝液或餾水中，塗片，負染色後立即鏡檢。也可37℃感作後立即塗片，鏡檢。　　(2)瓊脂濾過法：①和②與(1)相同，③製瓊脂板：吸取融化的08％瓊脂約15ml鋪在載玻片上，冷卻後備用。這種瓊脂板可冰箱保存數月。取一滴37℃感作後的抗原抗體複合物滴在瓊脂板上。隨即在複合物液滴表麵放置覆膜的載網，使膜麵向下漂浮在液滴上麵。④經一定時間後，液滴的液相漸漸擴散進入瓊脂層內，液滴逐漸扁平，載網下降，當複合物液滴中液相基本擴散完時，即可攝取載網負染。　　(3)瓊脂聚乙二醇法：這一方法是瓊脂過濾法的改良法，在瓊脂板下麵加聚乙二醇吸水。具體步驟如下：①配製聚乙二醇溶液，取30g聚乙二醇(PEG4000)溶解在100ml水中，振蕩，使其完全溶解。②把濾紙折疊成約2mm厚半個載玻片大小，浸泡在聚乙二醇溶液中數分鍾，充分浸濕後取出烤幹，放幹燥器內備用。③製瓊脂板。取1g瓊脂糖放於100mlpH72的巴比妥緩衝液中加熱溶解，用吸管吸取約15ml瓊脂溶液均勻地鋪在幹淨載玻片上，凝固後置濕盒中，冰箱保存待用。④用刀片切取適當大小的瓊脂板放在聚乙二醇紙片上，取一滴37℃感作後的抗原抗體複合物滴在瓊脂板上，立即用覆膜的載網麵向下浮在液滴上，當液相剛被吸收完時，立即攝取載網負染。　　 2.免疫標記電鏡　　免疫標記電鏡技術是應用在電鏡下可見的標記物標記抗體(或抗原)，使標記抗體(或抗原)具有原標記物和抗體(或抗原)的特性，然後用標記抗體(或抗原)與相應的組織或培養細胞內特異抗原(或抗體)作用，形成不溶性免疫複合物，即在電鏡下可見的標記物，以間接證實免疫反應的發生。理想的標記物應具備下述四個條件：①標記物與抗體應等價(摩爾比1∶1)，而且穩定地相結合，結合物應具有標記物和抗體蛋白的雙重特征，結合物不與特異抗原之外的其它物質形成非特異性結合。②標記物要盡可能小些。較大的標記物與抗體蛋白結合後，將使抗體蛋白的立體構造發生較大的改變，從而降低與抗原的結合力。同時，較大的結合物難於通過細胞的膜結構，不利於檢出細胞內的抗原。③在電鏡下，標記物最好呈細微顆粒狀，並具有足夠的電子散射力，使成像有足夠的反差。④抗原抗體標記物或抗原抗體抗抗體標記物反應後，其結合物在製片和觀察過程中不應移位或變性。　　完全滿足上述條件的理想標記物至今尚未發現。目前常用的標記物有：鐵蛋白、辣根過氧化物酶、膠體金等。　　(1)免疫鐵蛋白標記：　　馬脾鐵蛋白為直徑11～12nm的球形顆粒，分子量650～900kDa，由蛋白質外殼和鐵膠粒核心組成，核心直徑5～75nm。鐵膠粒含2000～3000個鐵原子，集中分布為四個小點，電鏡下為排列成菱形或方形的電子致密區，容易辨認。鐵蛋白標記多用於病毒或細胞表麵抗原的定位。　　①鐵蛋白的提取和純化：　　a.新鮮脾去除結締組織後剪碎加餾水(1500ml/Kg組織)，置組織搗碎器內製成勻漿。　　b.將勻漿置水浴中加熱至78～80℃，使鐵蛋白以外的蛋白質變性，然後用每平方厘米16目和100目的不鏽鋼網過濾或用四層紗布絞擠過濾。取濾液，7000r/min離心15分鍾。收獲棕紅色上清液，加固體硫酸銨(35g/100ml)，充分攪拌後置4℃過夜。　　c.3000r/min離心30分鍾，棄上清，用餾水洗下沉澱，裝入透析袋，4℃餾水透析，除去鹽類。　　d.加2％硫酸銨，待溶後以4～5％的量加入固體硫酸鎘，置4℃過夜。此時出現大量鐵蛋白結晶，離心後即可獲得棕色的粗製鐵蛋白結晶。　　e.將鐵蛋白結晶溶於少量2％硫酸銨中(pH585～59)，使溶液的蛋白質濃度為1％，3000r/min離心15分鍾。每100ml棕紅色上清液加5g硫酸鎘，使重新結晶，置4℃2～3天。3000r/min離心15分鍾，取沉澱。如此重複5～6次，可得到高純度的蛋白晶粒。　　f.將每100ml溶液得到的鐵蛋白結晶溶於75ml2％硫酸銨(pH585～59)，再加入等體積飽和硫酸銨，4℃過夜。3000r/min離心10分鍾，取沉澱。重複3次以上，除去鎘鹽。最後將硫酸銨沉澱物放4℃保存。　　g.使用前，將沉澱物溶於少量餾水中，4℃對水透析，去掉硫酸銨後，再以01mol/LpH72磷酸緩衝鹽水透析6～8小時。　　②鐵蛋白的鑒定：　　a.光學顯微鏡觀察：取少量鐵蛋白結晶體置載玻片上並加蓋玻片鏡檢。鐵蛋白晶粒為金黃色或棕黃色的四麵體或八麵體。　　b.電鏡觀察：將濃度為500μg/ml的鐵蛋白水溶液直接塗在覆膜載網上鏡檢或負染後鏡檢，可看到典型的單個鐵蛋白分子。　　c.聚丙烯酰胺凝膠電泳：75％聚丙烯酰胺凝膠電泳出現三條帶。　　③鐵蛋白與免疫球蛋白的結合：　　鐵蛋白與免疫球蛋白的結合，可用具有雙功能的異氰酸鹽類化合物如二異氰酸間二甲苯(mxylylenediisocyanate,簡稱XC)、2,4二異氰酸甲苯(toluen2,4diisocyanate,簡稱TC)作為偶聯劑。使用這種偶聯劑形成的結合物往往顯著降低抗體活力，這可能與偶聯劑的性質及某些作用條件有關。近年來多采用戊二醛作偶聯劑，相比之下，對結合物的抗體活力影響較小，標記抗體的產量也高。用戊二醛作偶聯劑有一步法和二步法。　一步法：將硫酸銨沉澱的鐵蛋白對水和pH7201mol/LPBS透析後，按Lowry法測定蛋白質含量，使其濃度在25％左右。γ球蛋白的濃度為45％左右。按蛋白質絕對量取鐵蛋白2份，γ球蛋白1份，混勻，然後加入1～2％戊二醛1/20份(戊二醛的最終濃度可為0005～005％)，攪勻後放37℃1小時，並不斷攪拌，再置4℃1小時。　　兩步法：在每亳升pH7001mol/LPB含50～80mg鐵蛋白的溶液中，加入稀釋的戊二醛，使其最終濃度為005～015％，總體積1ml，置37℃作用2小時。結合物經葡聚糖G25過柱，除去未結合的戊二醛。然後加入γ球蛋白，使鐵蛋白的最終濃度為15mg/ml，球蛋白的最終濃度為3mg/ml。將混合液置37℃感作12小時(無需攪拌)，加入001mol/L賴氨酸中止反應。　　反應後的產物有四種成分，即鐵蛋白標記抗體、未標記的γ球蛋白、未標記的鐵蛋白和剩餘的戊二醛。後者可通過對緩衝液透析或通過凝膠柱(葡聚糖G25或G50)除去。未標記的抗體球蛋白會競爭性地占據標記抗體與抗原作用的位置，未結合的鐵蛋白會引起非特異性反應，必須盡量除去。純化方法有鹽析沉澱法和超速離心法。鹽析沉澱法是在結合液中緩緩加入1/3體積的飽和硫酸銨，使成25％的飽和度。此時，棕黃色的鐵蛋白標記抗體沉澱，未標記的抗體和遊離的鐵蛋白仍留在上清中，4000r/min離心15分鍾，取沉澱物溶於少量01mol/L磷酸鹽緩衝液中，通過葡聚糖G25柱以除去硫酸銨，流速1ml/4分鍾，收集含有棕黃色的鐵蛋白標記抗體，對聚乙二醇透析濃縮。使用前測定蛋白質含量，濃度範圍為10～18％。　　超速離心法是將結合物經100000g1小時離心3次，鐵蛋白標記抗體和遊離鐵蛋白沉下，而未結合的抗體球蛋白則浮在上清中棄去。將沉澱懸浮在緩衝液中，結合鐵蛋白與遊離鐵蛋白用電泳分離，超速離心回收。　　可用瓊脂雙擴散法對標記抗體進行鑒定，用未標記的鐵蛋白和球蛋白混合物(按結合時的比例混合在緩衝液中)作對照。標記抗體產生的沉澱線呈棕黃色，於生理鹽水中浸泡數天不能漂去，以2％鐵氰化鉀酸性溶液染色，沉澱線變為普魯士藍色。混合物對照也出現沉澱線，沉澱線也呈棕黃色，但經生理鹽水漂洗後棕黃色消失。　　④電鏡樣品製備：　　電鏡樣品製備有直接法和間接法兩種。直接法簡便易行，但敏感度低；間接法，製備一種標記抗抗體可用於多種試驗，敏感度亦高，故一般多采用間接法。　　直接法是將培養細胞或組織經緩衝液漂洗後與特異性鐵蛋白標記抗體作用，37℃1小時，用緩衝液充分漂洗，除去未結合的標記抗體。常規固定、脫水和包埋。　　間接法是先用特異性抗體與被檢樣品結合，37℃感作1小時後離心去上清，以PBS洗數次後再與標記抗抗體37℃作用1小時，以PBS漂洗數次，除去未結合的標記抗抗體。以後過程與直接法相同。　　在進行細胞內抗原定位時，可采取下述措施打開細胞膜，增加細胞對標記物的通透性，然後再進行免疫結合試驗。　　a.凍融法。小塊組織或細胞經5％福爾馬林或1％戊二醛短時間(約5分鍾)固定後凍融一次，使細胞膜破裂。　　b.冷凍切片法。小塊組織短時間固定後,快速冷凍,切成10～15μm左右厚度的薄片。　　c.樣品經戊二醛短時間固定後，以4×10-5mol/L洋地黃皂苷處理1分鍾。　　為排除非特異性，必須進行對照實驗。一般設下麵幾種對照：(a)正常組織或培養細胞對照；(b)樣品先用未標記的特異抗體處理，然後再用標記抗體處理；(c)標記抗體先與特異抗原作用，再與樣品作用；(d)用非特異性標記抗體處理樣品等。上述4組對照都應呈現陰性結果。　　(2)免疫酶標記:　　免疫酶標記技術(immunoenzymatictechnique)是以酶為抗原抗體反應的標記物，它必須不改變抗原、抗體的免疫反應特異性，也不降低酶活性，而且與相應底物作用後形成不溶性的反應物。其結果是：光鏡下為有色的可觀察性終末產物，電鏡下為電子散射力強的終末產物(圖12-15)。用於免疫電鏡標記的酶有辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AKP或ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、葡萄糖氧化酶(GOP)等。目前最常用的是HRP。　　免疫電鏡技術對HRP的純度要求高，一般使用Rz30以上者為好，而商品酶往往低於此值，在實驗前要對Rz低於30的酶進行純化。　　酶標記抗體的製備方法甚多，免疫電鏡技術多采用戊二醛二步法。有關電鏡樣品製備的間接法介紹如下：　　①取材 如為單層細胞培養物，可先傾去培養液，用緩衝液洗1次後刮下貼壁細胞，離心成細胞小塊。如為組織，則需快速冷凍切片(切成約10～15μm厚的切片)，融化後置離心管內離心成細胞小塊。離心後傾去上清，加適量過碘酸賴氨酸多聚甲醛(PLP)固定液或者戊二醛多聚甲醛固定液固定。單層細胞於4℃固定05～1小時，組織則於4℃固定2～4小時。　　②抗體球蛋白感作 傾去固定液，用PBS洗3次，每次10分鍾，洗去剩餘的固定液。然後加入適當稀釋的抗體球蛋白，37℃或室溫感作2～4小時。感作後用磷酸鹽緩衝液洗3次，每次10分鍾，洗去未結合的抗體球蛋白。用25％戊二醛固定15～30分鍾後傾去固定液，用PBS洗3次，每次10分鍾，去掉剩餘的戊二醛。　　③標記抗體(抗抗體)感作 加入酶標抗抗體，37℃或室溫感作2～4小時，用磷酸鹽緩衝液洗3次，每次10分鍾，洗去未結合的酶標抗體。用25％戊二醛固定15～30分鍾，磷酸鹽緩衝液洗3次，每次10分鍾，洗去剩餘的戊二醛。　　④顯色 用005mol/L，pH76TrisHCl緩衝液洗5分鍾，傾去緩衝液。加入顯色液(取75mg3,3二氨基聯苯胺溶於100ml005mol/L，pH76TrisHCl緩衝液內，臨用前取所需量，於每ml中加1μl30％H2O2，使H2O2的最終濃度為003％)。室溫避光顯色15～30分鍾後，再以TrisHCl緩衝液洗數次。加入適量1％鋨酸固定液室溫固定1小時，餾水洗去剩餘的固定液。　　⑤常規脫水、包埋、切片 不染色直接鏡檢。 [HT5”SS]圖12-15 牛白血病病毒感染羊胎肺細胞的辣根過氧化物酶標記的免疫電鏡圖像　　 　箭頭所指的是被辣根過氧化物酶標記的病毒粒子，比例尺為200nm　　　               ——自李成等[HT5SS]　　(3)免疫膠體金標記:　　免疫膠體金標記技術又稱免疫金染色技術(immunogoldstainingtechnique)，是利用膠體金(colloidalgold)在堿性環境中帶負電荷的性質，使其與抗體相吸引，從而將抗體標記，製成免疫膠體金以研究抗原-抗體的關係，這是近年來發展起來的一項新技術(圖12-16)。 [HT5”SS]圖12-16 牛白血病病毒感染羊胎肺細胞的免疫金標記的電鏡圖像　　　　　　　　　 箭頭所指是被膠體金標記的病毒粒子，比例尺為100nm　　　           ——自李成等 　　氯化金(又名氯金酸，HAuCl4)水溶液在還原劑作用下形成的金顆粒，在顆粒之間因靜電作用而互相排斥，保持一個較穩定的膠體狀態，故稱膠體金。膠體金具有高電子密度和其表麵能結合生物大分子的特性。Faulk和Taylor於70年代初首先應用膠體金作為透射電鏡探針研究了沙門氏菌細胞壁表麵抗原的分布。近年來，該技術幾經改進，現已廣泛應用於免疫組織化學和細胞化學等方麵。該技術把免疫學中抗原抗體反應的高度特異性、敏感性與組織化學中形態的可見性有機地結合起來，可以在組織、細胞、亞細胞及分子水平上研究免疫作用。在透射電鏡領域內，該技術已成功地應用於標記病毒、細菌、紅細胞、骨髓細胞、淋巴細胞、血小板、腎細胞、肝細胞、神經元、垂體組織、十二指腸等的抗原和大分子方麵的研究。目前應用膠體金單克隆抗體技術研究病毒結構，更精確地將結構與功能有機地結合起來。該技術是當前在生物學研究中比較理想的標記技術，介紹如下。　①免疫膠體金標記技術的優點　　a.膠體金是一種粒性標記物，具有較精確的定位能力，對超微結構的分辨影響較小，最小的粒子能在高分辨電鏡下觀察。此點優於酶標，因酶標產生彌散、形態不整的產物，往往會影響被標記物結構的觀察；　　b.膠體金具有比鐵蛋白更高的電子密度，它不易與動物機體內存在的鐵蛋白及其產物相混淆；　　c.膠體金比其他標記物製備簡易，隻要有精確的試劑濃度、pH值和離子強度，就容易生產出好的產品；　　d.包被後膠體金顆粒的非特異性吸附比其他標記物低；　　e.膠體金顆粒具有較高的電子密度，因此具有較好的發射二次電子的能力，此點可用於掃描電鏡觀察；　　f.膠體金具有顏色反應，可用於光學顯微鏡觀察；　　g.采用不同還原劑以及通過劑量的控製可製成不同粒徑(3～150nm)的膠體金顆粒。小顆粒可在高分辨率的水平上進行觀察，同時由於其顆粒空間位阻小，能更多的結合特異部位而提高敏感性；應用大顆粒膠體金標記，可在較低分辨率的水平上進行透射、掃描電鏡觀察；應用不同大小的膠體金顆粒同時標記一個樣品，可用於多標記研究。②免疫膠體金標記技術程序　　a.膠體金的製備　　枸椽酸三鈉還原法 取001％HAuCl4水溶液100ml加熱至沸騰，迅速加入1％枸椽酸三鈉水溶液4ml，約5分鍾後出現橙紅色，所製備的膠體金粒徑約15nm，如將枸椽酸鈉的量分別減至15、10或075ml，則膠體金的粒徑分別增至約30、50或60nm。　　抗壞血酸還原法 將預冷至4℃的1％HAuCl4水溶液1ml、02mol/LK2CO3水溶液15ml、雙蒸水25ml混勻後，在磁力攪拌下加入07％抗壞血酸水溶液1ml，混合後立即呈紫紅色，隨後加入雙蒸水至100ml，加熱至溶液呈紅色。此法製備的膠體金粒徑為8～13nm。　　白磷還原法 將雙蒸水120ml、1％HAuCl4水溶液15ml與01mol/LK2CO3水溶液27ml混合，在緩慢攪拌中快速加入白磷乙醚溶液(附1)1ml，在室溫中慢速攪拌15分鍾，然後置100℃水浴30分種，貯存備用。此法所製備的膠體金粒徑為5～12nm。鞣酸枸椽酸鈉還原法 將1％HAuCl4水溶液1ml加入雙蒸水79ml中混勻為A液；另將1％枸椽酸鈉4ml、1％鞣酸07ml及01mol/LK2CO3水溶液02ml混合，加雙蒸水至20ml為B液。二者同時加熱至60℃，在磁力攪拌下將B液迅速加入A液中，繼續加熱攪拌至溶液呈亮紅色。此法所得膠體金粒徑為5nm。如將1％鞣酸用量變為001～4ml時，則粒徑可從15nm減至33nm。若需製備5nm左右的膠體金，最好應用鞣酸枸椽酸鈉還原法，此法所製備的金顆粒較均勻，而應用白磷法毒性較大，一般情況不用。b.膠體金抗體的製備(膠體金包被)膠體金對第二抗體(IgG)或葡萄球菌蛋白A(SPA)的吸附取決於其pH值，在接近蛋白質等電點或略偏堿的條件下，二者容易形成牢固的複合物，如果膠體金的pH值低於蛋白質等電點，則會聚集而失去結合能力。膠體金的pH值可用01mol/LK2CO3或01NHCl液調至待結合蛋白質的等電點或略偏堿(IgG的pH為90，單克隆抗體的pH為82，親和層析抗體的pH為76、SPA的pH為59～62)為宜。　　首先找出膠體金和第二抗體(IgG)或SPA最適結合比例，即用第二抗體或SPA(含量為1～2mg/ml)50μl，以0005mol/LNaCl倍比稀釋，分別於每一管中加入膠體金250μl，５分鍾後，各管再加10％NaCl液250μl，即可觀察到顏色改變。以沒有顏色改變的最高稀釋度作為膠體金和第二抗體或SPA結合的最適比例濃度。應用時再多加10～20％的抗體，以穩定蛋白質的實際用量。　　製備膠體金抗體時，按上述比例和要求，分別取所需量的膠體金及相應量的第二抗體或SPA，在磁力攪拌下將膠體金溶液加入第二抗體或SPA液中，10分鍾後加入3％聚乙二醇(分子量為20000)至最終濃度為005％,以進一步穩定包被後的膠體金。　　c.膠體金抗體的純化　　為了除去其中未結合的第二抗體或SPA及未充分穩定的膠體金和各種可能形成的聚合物，常用超離心法、凝膠過濾法純化，但最常用的是超離心法。該法是在裝好液膠的離心管底層加5％甘油005％聚乙二醇002％疊氮鈉溶液2ml作墊層，經120000g離心1小時，液膠最後濃縮在其管底部呈暗紅色(緊貼管壁的圓形液膠塊不要收集，收集時應避免上清液混入液膠中)。收集的液膠可以濃縮或稀釋成原體積的10倍，4℃保存。　d.應用膠體金抗體進行細胞抗原標記方法　　包埋前的標記法 以選用粒徑約5nm的膠體金為例。首先將被病毒感染的組織或培養細胞用1％多聚甲醛002％皂素0025％戊二醛液固定1小時(4℃)，然後用05mol/LTBS(pH74)溶液(附2)洗30分鍾，加適當稀釋的相應高免血清(第一抗體)於室溫作用30分鍾後，4℃過夜，以002mol/LTBS(pH82)溶液(附3)洗2～3小時，加適當稀釋的膠體金抗體，於室溫作用30分鍾，4℃過夜(最好在輕微攪拌下)，用002mol/LTBS洗5次以上，持續數小時(伴有輕微振動)。以後各步驟(戊二醛、鋨酸固定、脫水、包埋、切片、鈾鉛雙染色及電鏡觀察)按常規進行。　　超薄切片後標記法 該法通常是在冷凍切片、低溫包埋切片或常規包埋切片後進行。後標記的優點是可以標記細胞中任何部位的抗原成分，對細胞的超微結構和功能生物大分子的發生、分布和相互作用的研究都很有意義。　　e.常規包埋切片的免疫染色法步驟　　超薄切片80nm左右(也可5～70nm)，置於無支持膜的300～400目鎳網(或銅網)上；　　置1～10％H2O2液中處理10分鍾～1小時，視環氧樹脂硬度和切片厚度而定，(環氧樹脂越硬，需H2O2濃度越高)，以除去鋨酸和增進樹脂的穿透性，利於抗體進入；雙蒸水洗3次，每次5～10分鍾；浮於正常羊血清(1∶50～1∶100)滴上，室溫30～60分鍾；PBS(內含1％牛血清白蛋白,pH82)中漂洗5分鍾；加適當稀釋的膠體金標記抗體液(1∶30～1∶100)，淡紅色為適宜稀釋度，置4℃20小時或室溫10～120分鍾；雙蒸水洗3次，每次3分鍾；醋酸鈾和枸椽酸鉛電子染色，待幹後電鏡觀察。　　f.LowicrylK4M低溫包埋切片的染色步驟　　1％BSA室溫孵育30分鍾；第一抗體作用，於4℃過夜或室溫2小時；水洗，用PBS洗3次，每次10分鍾；蛋白A膠體金(PAG)在室溫作用1小時；水洗，用PBS洗1次，雙蒸餾水洗1次；電子染色，用醋酸鈾和枸椽酸鉛液按常規法染色。g.膠體金抗體對病毒懸浮樣品的標記方法　吸取病毒懸浮液10μl，滴在蠟盤上，將載膜的銅網膜向下放在懸滴上，經10～15分鍾吸附，多餘的液體用濾紙吸幹；吸取適當稀釋的相應抗血清(第一抗體)10μl滴在蠟盤上，將載樣品的銅網放在液滴上，感作約2分鍾；用015mol/L磷酸鹽緩衝液(pH72)衝洗5次；吸取膠體金第二抗體10μl滴在蠟盤上，將上述衝洗後的銅網放在膠體金液滴上，經3～15分鍾感作；用上述磷酸鹽緩衝液衝洗6次，雙蒸水衝洗2次，用濾紙吸幹；用2％磷鎢酸(pH65)負染色約30秒鍾，用濾紙吸幹，電鏡觀察。h.操作中幾個需要討論的問題　包被後的膠體金凝集現象，是該濾液中含鹽成分過多之故。一般情況下，蛋白質大分子應當在無鹽或極低鹽濃度的環境中。另一方麵，液膠的pH值對凝集也有很大關係，應調整到蛋白質等電點或略偏堿一點的範圍，每一步驟的衝洗液也應符合所衝洗物的pH值。非特異性反應問題，應注意以下幾點：第一抗體及膠體金抗體應稀釋到最佳稀釋倍數；抗體成分要純；在操作步驟中衝洗要充分，尤其分別在第一抗體和膠體金抗體感作之後，一定要徹底衝洗，以除去未作用的反應物；由於包被後的膠體金溶液中含有未結合的多餘蛋白質(第二抗體)，而這些蛋白質的分子量比包被後的膠體金抗體小，因此，在與第一抗體抗原複合物結合中，它搶先占據了抗原(第一抗體抗原複合物)結合的位置，使膠體金抗體相對地減少了結合的數量，所以在電鏡下，在有些抗原位置上本應有膠體金存在，卻看不到膠體金標記現象。關於膠體金穿透性問題，盡管在標記過程中為了增加細胞膜的通透性，加了皂素，但效果仍不理想。在細胞內的抗原位置和抗原集團內部仍很難發現膠體金標記現象。有人用冷凍斷裂超薄切片法進行膠體金細胞內抗原定位，增加了細胞內部的通透性。　　附1：白磷溶液製備 在水中將白磷切成小塊，用鑷子快速投入約20ml乙醚中使達飽和狀態，輕輕搖動至少2小時後，取上清液，以4800g離心20分鍾，吸取上清液用乙醚稀釋5倍，立即使用(注意，凡含有白磷的剩餘物要用適量硫酸銅溶液破壞其毒性後方可倒掉)。　　附2：005mol/LTBS(pH74)溶液配製　　     Tris(三羥甲基胺基甲烷)  NaCl  蒸餾水121g175g1500ml[FL)]  在磁力攪拌下滴加濃HCl至pH74，再加蒸餾水至2000ml。　　附3：002mol/LTBS(pH82)溶液的配製　　     Tris  NaCl  牛血清白蛋白(BSA)  NaN3(疊氮鈉)  蒸餾水484g175g20g10g1500ml   在磁力攪拌下用濃HCl滴至pH為82，再加蒸餾水至2000ml。

 

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