冷凍超薄切片-電鏡樣品的特殊製備技術

　冷凍超薄切片技術是在光學顯微冷凍切片和電鏡超薄切片的基礎上發展起來的。由於常規超薄切片技術中應用化學固定、有機溶劑脫水、樹脂包埋等一係列處理，均可使生物樣品受到物理和化學性損傷，引起組織和細胞內蛋白質分子變性，大部分可溶性成分及某些生物大分子物質被抽提或發生移位。為了彌補這些缺陷，人們創造了冷凍超薄切片技術。70年代後，出現商品冷凍超薄切片裝置，使該技術有了更大發展。目前，此技術可在分子水平上研究新鮮生物樣品的超微結構、各種生物大分子和某些元素在細胞內的分布狀態，並在細胞化學、免疫電鏡、X射線微區分析及可溶性物質放射自顯影研究等方麵發揮巨大作用。　　冷凍超薄切片技術主要操作程序：　　 1.樣品預處理冷凍超薄切片樣品的預處理，包括兩種方法:一種是樣品直接冷凍固定，該法有利於保存生物樣品中可溶性物質及生物大分子的活性、天然構型和保持元素的分布狀態，主要用於生物樣品內可溶性物質的放射自顯影和X射線微區分析；另一種是對樣品先采用戊二醛固定、冷凍保護劑浸泡等預處理，此法適用於細胞化學、免疫電鏡等超微形態學研究。現將後一種方法介紹如下：(1)取材,為了保證製樣效果，樣品塊越小越好，以小於1mm3為宜(直接冷凍法也相同)；(2)固定,用01mol/L二甲胂酸鈉緩衝液(pH72)，將戊二醛配成25％的溶液，把取材後的樣品塊放入該溶液中固定15～60分鍾。依實驗材料和研究目的不同，固定液的濃度及固定時間可適當改變。如用1％戊二醛固定5分鍾，可較好保存心肌線粒體脊上球狀蛋白質的構形；用02％戊二醛固定15分鍾(4℃)，適於細胞內抗原的免疫鐵蛋白標記的研究；(3)冷凍保護處理,當樣品冷凍時，其細胞內液開始凝固時的溫度，稱為“冷凍點”，含水量80％的細胞約為-30℃。經逐漸冷卻，水份就慢慢形成冰晶。如果冰晶太大就會使細胞變形移位，但到低於-80℃的超冷凍期時，就發展到“再結晶點”。超過此點以後，就不形成冰晶。冷凍的細胞內液成為均勻的玻璃狀。冷凍保護劑的作用是為了提高細胞內液的濃度，降低冷凍點，從而減少冰晶形成。常用的冷凍保護劑有20～30％甘油、06～23mol/L蔗糖、20％二甲基亞碸(DMSO)、5％聚乙烯醇溶液等。處理時間從幾分鍾到幾小時,一般認為甘油溶液是比較理想的防凍處理液，因為它具有潤濕劑的作用，有利於負染色液的鋪展與染色。 2.快速冷凍固定冷凍超薄切片質量的好壞直接決定於快速冷凍效果。常用的快速冷凍方式有二：一是液氮直接冷凍；二是金屬接觸冷凍。後一種方法較好，即將銅塊先置於液氮中，待溫度平衡後，將樣品與銅塊接觸5～10秒鍾，以達到快速傳導降溫的目的，然後再將樣品置於液氮中待用。 3.切片　(1)冷凍超薄切片機：該機是在固有型超薄切片機基礎上附加低溫操作裝置組成的。常用的機型是配以LKBCryoKit冷凍裝置的瑞典LKBⅢ型(或Ⅴ型)超薄切片機。該裝置包括：冷凍室、冷凍刀台、冷凍樣品頭、存放液氮的杜瓦瓶及溫度和液氮水平控製器等。冷凍室是一個具有絕緣性能的塑料箱。它將冷凍刀台和冷凍樣品頭罩在其內。刀台、樣品頭分別有管道與杜瓦瓶相通，並通過管道不斷向它們輸送液氮；在刀台和樣品頭內有溫度傳感器及加熱裝置，有盛致冷劑的容器，容器內還有致冷劑水平感受器。當用液氮作致冷劑時，其樣品頭溫度可控製在-70℃～-170℃，刀溫控製在-70℃～-150℃。溫度傳感器是由溫度及液氮水平控製裝置進行自動調節,其調節過程是向刀台和樣品台的致冷劑容器中灌滿液氮。若將控製裝置的溫度選擇在-100℃的位置，刀台和樣品頭的溫度下降到-100℃以下，則傳感器即給控製裝置發出溫度下降的信息，控製裝置即可通過加熱器產生補償的加熱電流，使刀台與樣品頭的溫度保持在-100℃的狀態。在切片過程中，由於液氮的不斷消耗，致使容器中的致冷劑不斷減少而液麵下降，容器中的白金電阻器可感受液氮量的變化。當液麵低於預定標準時，白金電阻器即可引起杜瓦瓶中的加熱器工作以提高瓶中的壓力，使瓶中的液氮向致冷劑容器中流動，直至容器中的液麵又恢複到原來的水平為止。(2)切片操作：①向刀台和樣品頭的致冷劑容器中倒入液氮，使冷室的溫度達到穩定的低溫狀態；②安裝冷凍的樣品頭、玻璃刀(或鑽石刀)，調整刀與樣品的距離，調好溫度及液氮水平控製裝置；③自動切片，冷凍超薄切片的具體方法有以下兩種：一是濕刀法，即用液槽法。切片槽裏的液體需在低溫下不凍結的液體，如二甲基亞碸、甘油、乙烯乙二醇、異戊烷等。當用二甲基亞碸時，其6％的水溶液在-60℃時可不結凍。切片時樣品的溫度常為-60℃～-80℃，刀溫高於樣品溫度10～20℃為宜。其操作與常規超薄切片法相同，但宜放慢切片速度；二是幹刀法，即不用液槽法，而用滴管上的飽和蔗糖液滴，粘起玻璃刀上的切片，然後將凝固的蔗糖液滴從冷凍室裏移出，在室溫下待蔗糖融化後，利用其表麵張力使切片展平，並放在附有支持膜的載網上，用雙蒸餾水洗去蔗糖後染色。但亦有人用注射器吸取30％甘油或二甲基亞碸液滴的方法，同樣獲得滿意效果。 4.染色冷凍超薄切片可采用正染色或負染色。一般的形態學觀察和超微結構研究，用負染色法為好。該法簡單快速，有利於保存結構和分辨率高等優點。常用的負染色劑有磷鎢酸(02～1％,pH65～85)、醋酸鈾(05～3％,pH45～52)等，染色時間為5～60秒。如用正染色，應考慮到冷凍切片沒有包埋介質支持，因此切片非常脆弱，須倍加小心操作。

 

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