組織和細胞的培養方法-組織培養-病毒的培養

3.細胞培養〖HT〗自1949年Enders等報道脊髓灰質炎病毒在非神經細胞內培養成功並形成細胞病變以來,隨著細胞汙染和分散劑的進一步解決,已有數百種動物病毒在細胞培養上獲得成功。現代組織培養技術已能使動物的絕大多種細胞在體外培養增殖,並培育出多株二倍體細胞株、可以長期傳代的異倍體細胞係、融合細胞以及外源基因導入細胞等多種用途的細胞。細胞培養與實驗動物和雞胚相比,不僅經濟、方便、省時、省力,而且能提供大量生物性狀穩定的細胞群體,降低了外界因素的影響,使實驗結果更加準確可靠。因此,細胞培養是病毒學實驗研究必不可少的重要工具和手段。在臨床病毒學上常用的細胞類型可分為原代細胞、二倍體細胞株和傳代細胞係三大類,其中以原代細胞對病毒最敏感。從細胞的來源則可分為人源、各種動物源、禽源和昆蟲源等。雖然各種病毒均對其來源動物的細胞最敏感,但也有很多細胞(如雞胚成纖維細胞等)和傳代細胞株、細胞係(如BHK細胞係等),對其來源動物種類以外的多種病毒也能感染。經過細胞培養傳代的毒株,其細胞適應性(細胞感染範圍)常更為廣泛。從細胞培養方式的不同,可分為靜止培養、轉管(瓶)培養和懸浮培養等,其中以靜止的單層細胞培養最為常用。懸浮培養及轉瓶培養適於大規模培養細胞,是生產疫苗、幹擾素、激素、單克隆抗體和基因工程多肽等生物製品的重要手段。此外還有著眼於擴大細胞培養麵積的微載體培養法等。(1)單層細胞培養:現將細胞培養過程中,關於細胞密度、營養液pH、換液和培養溫度等幾個帶共性的問題介紹如下。細胞密度:一般講,密度大些的細胞生長快,但過大對細胞生長不利,而且細胞很快老化。原代腎細胞的密度以每ml營養液中含40～60萬個為宜。雞胚成纖維細胞約50萬/ml。傳代細胞係最少,約20～30萬/ml。營養液pH:細胞生長最適的pH範圍為70～74。細胞通常可耐受pH66～78較大範圍的變化,但在偏酸、偏堿環境下的持續時間不宜超過24小時,否則細胞將很快老化和脫落。生長液pH較偏堿更適於細胞貼壁,但培養時的pH仍應保持在72～74之間。因為細胞代謝產生的酸性物質很快使pH下降,而影響細胞繼續生長。維持液可稍堿些,調到pH74左右。使用CO2溫箱能提供穩定的5%CO2,可以有效地自動調節細胞代謝引起的酸堿度變化。另外在培養液中加入氫離子緩衝劑(如HEPES)能增強培養液的緩衝能力。換液:原代細胞生長較慢,在培養48～72小時左右換液,能促進細胞增殖,盡快長成單層。以後則視實驗需要和pH變化隨時換液。傳代細胞生長旺盛快速,在48～72小時長成單層後,應及時換液和使用。如果培養隻是為了傳代保存細胞,則應於換液後24～48小時,即細胞處於生命旺盛時進行下一次培養傳代。換液,通常是將舊液全部換為新液,但細胞生長緩慢而且形態不正常時,可隻換入一部分新液,保留1/4～1/2的舊液。培養溫度:細胞的培養溫度應與細胞來源動物的體溫一致或略低1～2℃。細胞通常能耐受較低溫度,但增殖緩慢,多數細胞在30～32℃時,仍可維持其基本代謝和形態。細胞對高溫敏感,溫度提高2～3℃即產生不良影響,首先發現形態改變,隨後則發生脫落和死亡。盛夏季節炎熱潮濕,更要注意無菌操作,防止細胞遭受細菌、尤其是黴菌汙染。單層細胞培養是研究病毒生物學特性以及病毒與細胞相互作用過程的合適模型。應用單層細胞培養病毒,常可獲得大量高效價的病毒液,用以製造特異性病毒抗原或病毒疫苗。同時,由於單層細胞培養法的設備條件和操作方法比較簡單,因此,單層細胞培養已是當前病毒學中應用最廣泛的一種細胞培養方法。下麵重點介紹幾種單層細胞的培養方法。①原代細胞培養:應用動物組織器官或胚胎,經過剪碎、消化分散成單個細胞後進行的培養,即為原代細胞培養。將長成單層的原代細胞培養物,再進行消化分散成單個細胞後繼續培養,以及隨後的連續傳代培養,則稱繼代細胞培養。這種培養細胞可保持原來的二倍體形態,對病毒比較敏感,尤其是原代細胞培養。各種組織原代細胞的培養方法大體相同,舉有代表性的胚胎和組織及白細胞培養方法說明如下。1)雞胚原代細胞:在無菌條件下采取9～10日齡雞胚,置滅菌平皿中,除去頭(或僅除去喙和眼)、爪和內髒,並剪成塊,用Hanks液等充分衝洗後移入大號鏈黴素瓶或其他廣口瓶中,用眼科彎形剪將其剪成1mm大小的碎塊,加入Hanks液或其他洗液,充分衝洗,並靜置幾分鍾,待組織塊下沉,吸棄上層液體,再加洗液,如此反複衝洗2～３遍後,吸棄上清液。於沉澱組織塊內加入約4倍量的025%胰酶,並調整pH至76～78振蕩混勻後置37℃水浴中感作30分鍾,每10分鍾輕輕搖動一次。取出後小心吸棄上層胰酶溶液,用洗液輕洗2次後,即在洗液內以大口吸管吹打數次或十數次,此時即見大量細胞遊離,液體變渾,經用雙層亞麻布或72孔不鏽鋼紗網過濾,收集於離心瓶(管)中,以600r/min的速度離心沉澱5～10分鍾,吸棄上清液,按每個雞胚5ml的量,加入營養液,並用吸管充分吹打,直至形成均勻的細胞懸液,準備細胞計數。細胞計數時,取上述細胞懸液05ml,加入01%結晶紫-枸櫞酸(01mol/L)溶液2ml,置室溫或37℃溫箱中5～10分鍾,充分振蕩後,用毛細吸管或吸血管吸取,滴入血細胞計數板內,按白細胞計數法計數四角4大方格內的細胞總數。注意僅計數胞核與胞漿完整的細胞,成堆的細胞按一個細胞計算。將4大方格內的細胞總數按下列公式換算成每ml細胞懸液中的細胞數:〖JZ〗每ml細胞數=〖SX(〗4大方格細胞總數〖〗4〖SX)〗×10000×稀釋倍數根據細胞計數結果,再用營養液將細胞懸液進一步稀釋為每ml含50萬個細胞的濃度,即可裝瓶培養。每個小試管或青黴素瓶裝1ml,每個25ml容量的小瓶裝4ml,每個100ml容量的長方形培養瓶裝10ml。置36～37℃溫箱內培養。雞胚細胞在1～2小時內貼壁,幾小時至十幾小時後開始生長,24～48小時長成單層。此時即可更換維持液,並接種病毒。雞胚細胞常用的營養液為:〖ZZ3〗生長液〖WX(!11KG7,5YQ〗05%乳白蛋白水解物〖〗97ml〖〗犢牛血清〖〗2～5ml〖〗抗生素溶液〖〗1ml〖WX)〗以碳酸氫鈉溶液調整pH至72～74。〖ZZ3〗維持液〖WX(!11KG7,5YQ〗05%乳白蛋白水解物〖〗98ml〖〗醋酸鈉溶液(240mg/ml)〖〗1ml〖〗抗生素溶液〖〗1ml〖WX)〗根據需要或細胞生長情況,加或不加1～2%犢牛血清,並以碳酸氫鈉溶液調整pH至76左右。雞胚細胞當然也可用人工綜合營養液培養。各種組織的原代細胞培養,除常應用上述熱消化方法外,也可用冷消化法,兩者效果相同。方法很簡單,即在普通冰箱中靜止放置14～18小時,代替上述的37℃水浴消化。其它程序相同。若想將原代細胞培養物繼續傳代時,應於換液後1～2天挑選細胞形態好密度又大的培養瓶,傾棄營養液,經Hanks液洗2～3遍後,加入胰酶消化液少許(能將細胞單層麵鋪上一薄層為度)消化數分鍾(其間不時搖動消化液),當看到細胞單層變白和出現空洞時,用手掌拍打瓶壁,此時細胞即很快全部脫落。先加入少量營養液,用吸管吹打分散細胞後,再按培養瓶原來液量的2倍加入新營養液,混勻並分裝成兩瓶後繼續培養,即為繼代培養細胞。原代細胞一般比較容易在繼代培養中生長,但繼續向後多次培養傳代時,細胞往往生長不良,並逐漸衰落死亡。2)倉鼠腎原代細胞:取10～14日齡的幼倉鼠,剪斷頸動脈放血至死。用自來水適當衝洗,以除灰塵,置清潔搪瓷盤中,背向上,移入無菌室或無菌罩內,先後用碘酊和70%酒精充分消毒,用剪刀沿背中線剪開,並向四肢延展。更換鑷子及剪刀,將皮膚撕向兩側,露出背部。再換剪刀,於肋骨後剪一長約1cm的切口,將鑷子插入切口夾住腎髒,剪斷附連物後,將腎移入滅菌平皿內。按同樣方法取出另一側腎。另一個更簡單且較少汙染的方法,是在將幼倉鼠頸動脈放血致死後,即在頸胸交界處全周地剪開皮膚,朝尾部方向撕下整個鼠皮。隨即置清潔搪瓷盤內,並送無菌室(罩)內采腎如前述。隨後在平皿內剪除附著在腎髒上的脂肪,並剝去腎包膜,用剪刀將腎平剪成兩半,剪除腎盂部分,用Hanks液衝洗,移入廣口玻璃瓶中剪碎,洗滌後加入025％胰酶消化。消化可在37℃水浴中進行熱消化。也可將其置於4℃冰箱內作冷消化,一般在靜置條件下冷感作14～18小時。消化後的操作和計數方法同前。通常作成每ml50萬的細胞懸液。培養方法亦如前述。倉鼠腎原代細胞的生長液可用加有10%犢牛血清的05%乳白蛋白水解液,維持液的血清用量減半或減至2%～3%。人們目前樂於應用人工綜合營養液。3)皮膚原代細胞:各種動物的皮膚均可培養,但以胎兒皮膚為宜。一般由腹部或後肢內上側剪取皮膚,按上述方法進行衝洗、消化和培養。以025%胰酶於4℃冷消化18～20小時的效果較好。營養液為含30%犢牛血清的05%乳白蛋白水解物;或05%乳白蛋白水解物與E〖DK〗MEM的等量混合液,內含30%犢牛血清,pH72。維持液的血清含量減至20%。由於皮膚細胞的分散比較困難,胰酶消化後往往仍有較大的顆粒狀組織塊,培養時經常懸浮於營養液內,不易貼壁,難於形成單層。現介紹一個簡單而比較有效的方法。作者等試用於驢胎皮膚細胞的培養,較易形成單層:采取皮後將其切(剪)成1mm見方的小塊,以大量洗液衝洗,吸幹洗液後加入少量營養液。應用彎頭大口吸管吸取營養液和組織塊,注入培養瓶中,使每個100ml容量的培養瓶含有1～15ml的營養液和30～40個組織塊,並用吸管頭將組織塊適當地分散排列。因為培養瓶內的營養液很少,組織塊基本上暴露於空氣中,僅使玻璃瓶的培養麵保持於濕潤狀態而已。如果培養瓶內的營養液太多,組織塊漂浮於其中,則應將多餘營養液吸走。稍稍扭鬆瓶塞,置CO2溫箱中,於37℃靜置培養1～2小時,隨即取出,塞緊瓶塞,以保持瓶內具有一定量的CO2。置37℃普通溫箱內培養1～3天,此時多數組織塊已經貼壁,即可沿瓶頸緩緩加入1ml營養液。此後每2～３天加一次營養液,每次加入1～3ml,直到加至10ml。如果細胞生長旺盛,常可一次加足至10ml。待其長成單層,即可換液,並接種病毒。換液時用力振蕩,可使原來的組織塊脫落,而僅留下生長旺盛的單層細胞。4)骨髓原代細胞:無菌采取動物(胎兒)長骨,折斷後刮取骨髓,置營養液內用大口吸管充分吹打,收集混濁液體,移入另一滅菌瓶中,稍予沉澱(約1～2分鍾)。此時瓶底有較大塊狀物的沉澱,液麵則有油脂漂浮。另換吸管或連有針頭的無菌注射器,小心吸取中層混濁液體,分裝培養。24小時後觀察,細胞已經貼壁,再待1天後換液。置低倍鏡下觀察,可見許多纖維樣或長梭形細胞,並有大量圓形和短梭形細胞分布其中。這是骨髓中造血幹細胞和結締組織細胞等多種細胞的典型混合圖象。此時接種病毒,病毒選擇性地在敏感細胞內生長,而不敏感細胞則常繼續增殖。培養豚鼠、倉鼠等小實驗動物的骨髓細胞時,可先剪去長骨兩端,隨後用注射器吸取營養液,壓入長骨腔,衝洗出腔內的骨髓細胞,吹打混合培養。骨髓原代細胞的營養液可以選用①全犢牛血清;②犢牛血清與05%乳白蛋白水解物的等量混合液;③犢牛血清與199或E〖DK〗MEM的等量混合液。pH為72左右。5)馬屬動物原代白細胞:可在體外玻璃瓶內貼壁培養的白細胞,其實隻是血液中的巨噬細胞,即大單核細胞。多形核細胞雖可貼壁,但於3～6天內自行脫落。淋巴細胞不貼壁,一般隻作懸浮培養。由於馬屬動物的血沉很快,因此容易由靜置的抗凝血液的血漿部分取得白細胞,不必采用特殊的白細胞分離技術。先在采血瓶內按采血量加入肝素溶液,並置冰箱內適當預冷(以減少白細胞對采血瓶的貼壁)。由動物頸靜脈采血,搖勻後盡快置4℃冰箱內,靜置30～40分鍾,待紅細胞完全沉澱後,用吸管小心吸取上層血漿,置離心瓶(管)中,加入Hanks氏液或Earle氏液,振蕩混合後,以1000r/min的速度離心沉澱10分鍾,傾棄上清液,加少量洗液,懸起沉澱細胞,充分混勻,再加洗液至滿瓶,以800r/min的速度離心沉澱10分鍾。傾棄上清液,加入牛血清,以吸管充分吹打,混勻後進行細胞計數,最後稀釋為每ml含細胞1000～2000萬個。裝瓶培養,1～2小時後細胞貼壁,24小時後可見細胞出芽,此時或再待12～24小時後換液,同時接種病毒。應用牛血清培養馬屬動物白細胞,存在一個所謂的“對號”問題,也就是某批牛血清適於某匹或某幾匹馬、騾、驢的白細胞的培養,但用於另一匹或另幾匹馬、騾、驢的白細胞即不能獲得良好的培養結果。因此必須事先試驗各批牛血清與各該動物白細胞的適合性。根據我們的經驗,以2～3頭牛的混合血清較好。培養馬和騾的白細胞,最好應用犢牛血清,驢白細胞的培養要求稍低,可以應用成年牛血清。也可分別應用含血清50%和20%的199人工綜合營養液、E〖DK〗MEM營養液作為生長液和維持液。有人建議生長液中的血清含量不要超過20%,據雲血液巨噬細胞在這種營養液內的發育較慢,但可以長期活存達幾周之久(於5%CO2環境中)。血液中淋巴細胞的培養,可按上述同樣方法製備白細胞培養懸液,並用營養液將其進一步稀釋成每ml約含2000萬細胞的濃度。傾入滅菌平皿或培養瓶內,液麵厚度不超過2～3mm,37℃靜置培養一小時。隨後吸出上層液,注入另一滅菌平皿或培養瓶內,如上37℃靜置培養一小時。由於單核巨噬細胞、多形核白細胞等均已吸附於玻璃表麵,吸取的上層液中主要就是淋巴細胞。用營養液將其稀釋成1106～7個細胞/ml,即可分裝培養。營養液為PRMI1640,內加20%犢牛血清。置5%CO2環境中培養,約可活存2周(此時活細胞約占細胞總數的50%～55%)。如在營養液內加入植物血凝素(1～30μg/ml),可使淋巴細胞激活,並分化為母細胞,顯微鏡下可見出芽和增殖現象。6)豬、牛等動物原代白細胞:豬、牛及其他血沉緩慢的動物的白細胞,不能應用靜置抗凝血的方法。因此,必須采取相應的措施,才能取得白細胞。采取肝素抗凝血如前,立即加入等量的犢牛血清或1/5量的6%葡聚糖PBS溶液,4℃冰箱靜置1小時,吸取上層血漿,如上收集白細胞、洗滌和培養。由於葡聚糖的分子量不同,而各種動物血液成分的比重也不盡相同,因此必須通過預備試驗,調整葡聚糖溶液的濃度或其加入量,務使紅細胞在靜置時較快下沉,上層血漿中含有較多的白細胞。上述的葡聚糖濃度及其加入量是指分子量為184000的葡聚糖。作者等采用餾水裂解紅細胞的方法,成功地分離和培養了豬和狗的血液巨噬細胞。具體方法是采血於盛有玻璃珠的脫纖瓶內,充分振搖脫纖。隨後將脫纖血吸入或傾入另一離心沉澱瓶(管)內,以1500r/min的速度離心沉澱15分鍾,吸出上層血清,保存備用。於沉澱血細胞中加入12倍容量的三餾水或去離子水,充分振蕩混合,再以1200r/min的速度離心沉澱12分鍾,小心傾出黑紅色溶血液,瓶底留下6～7ml底液(指50ml離心瓶)。再加餾水10ml,振蕩混合後立即加入洗液至滿瓶,再以1000r/min的速度離心沉澱10分鍾。屆時取出,可見瓶底有白色或紅白色沉澱細胞。如紅細胞太多,可傾棄上清液,並加洗液至滿瓶,再以900r/min的速度離心沉澱10分鍾,即可獲得白色的細胞沉澱。加入少量營養液,充分振蕩混合,經細胞計數後再行稀釋為每ml含1000～2000萬個細胞的細胞懸液。豬、牛、狗及其他動物的白細胞也可用全犢牛血清培養,或者應用犢牛血清和199人工綜合營養液(或PRMI1640)的等量混合液。維持液中的血清含量減至20%。血液中白細胞的分離方法頗多,例如葡聚糖-泛影葡胺分層法、明膠沉澱法和玻璃纖維(玻璃珠)吸附-洗脫法等等。這些方法或則操作比較複雜,易於汙染,或則隻適用於小量血液樣品中白細胞的分離,病毒實驗室較少應用。②二倍體細胞株培養:二倍體細胞株的增殖代數與其來源動物有一定關係,如人胚肺細胞株可傳50代或更多的代數,而馬和牛的胚胎細胞株的傳代次數較少。醫學上很重視二倍體細胞,如由人胚胎建立的成纖維細胞株,廣泛用於人類病毒病的診斷、藥物篩選和疫苗製造。特別是人用疫苗生產,醫學上大多使用二倍體細胞。但美國最近批準使用Vero傳代細胞係生產人用狂犬疫苗。來源於動物組織的二倍體細胞株也不少,但目前應用不廣泛。獸醫實驗室包括生物製品廠一般多應用原代細胞和傳代細胞係,但疫苗生產最好不用傳代細胞係。一些實驗室常根據需要自行培育繼代細胞株。我們實驗室就曾建立過馬屬動物的傳代細胞株。傳代細胞株使用的營養液與其原代細胞培養基本相同,不再贅述。現就如何建立二倍體細胞株作扼要介紹。建立細胞株不是一件輕而易舉的事,特別是從3代到7、8代是最不穩定時期,細胞很容易喪失貼壁、增殖能力而衰落死亡。在建株培養傳代過程中,主要應注意以下幾點:原代細胞培養的組織盡可能取自動物胚胎或新生動物,並立即培養;實驗設計出最適於該種細胞的生長液和維持液配方,其營養成分應適度豐盛,尤其在生長困難的前期;傳代時選用合適的細胞分散劑,尤應注意消化的時間不要過長;傳代時接種的細胞數要比一般高05～1倍,寧多勿少,視情況可一瓶傳一瓶,或兩瓶傳一瓶,而且一定要利用原瓶(原瓶比新瓶更適於細胞生長);要根據組織來源和動物種類,選擇適合的培養溫度;培養過程中要根據繼代細胞的形態、增殖程度和營養液的pH等,適時地進行換液和傳代,應在細胞生長最旺盛、形態最好的時候傳代,不要錯過時機,此點尤為重要。為了提高細胞的適應性和成活率,可在原代培養中故意加入一些組織塊(可取自消化後殘剩的小組織塊)與單個細胞同瓶培養。這些組織塊大部能像單個細胞一樣貼壁,並在其周圍呈放射狀地長出細胞。下次傳代時,仍將殘留的組織塊消化下來後繼續培養,直至消失。另外,在培養過程中如發現細胞生長不太好,但又到了換液的程度時,可置換部分新液,而殘留1/4～1/2的舊液,以利於細胞的適應性和增殖。經過5～7代培養,生長良好的繼代細胞,應大量凍存於液氮中備用。在繼代過程中,每間隔8～10代,應對細胞的染色體組型進行檢查,看其是否仍保持二倍體狀態。如果發現染色體組型已經改變,表明細胞在傳代過程中已發生突變,成為可以無限期增殖傳代的細胞係。③傳代細胞係培養:傳代細胞係種類繁多,其中多數來自人和動物的腫瘤組織,部分來自發生突變的正常細胞,它們喪失和改變了原細胞固有的特性,變成了能長期在體外培養傳代的異倍體癌變細胞。傳代細胞係的優越性不僅在於可以無限的傳代,而且不少細胞係對病毒也很敏感,尤其是某些傳代細胞係能在懸浮培養條件下增殖,適合病毒抗原的大量生產。傳代細胞係不僅容易培養,而且生長旺盛,繁殖快速,對營養條件不苛求。但很多傳代細胞係在長期傳代過程中遭到支原體和病毒的汙染,特別是支原體更為常見,從而影響實驗的科學性和準確性,這是在使用傳代細胞係時必須注意的問題。獸醫病毒學實驗室常用的傳代細胞係種類很多,如我們實驗室經常保有Vero(非洲綠猴腎細胞)、BHK〖DK〗21(乳倉鼠腎細胞)、MDCK(犬腎細胞)、IBRS〖DK〗2(豬腎細胞)、F81和MA〖DK〗104(貓腎細胞)、FL(人羊膜細胞)及HeLa(人子宮頸細胞)等細胞係。不用時保存於液氮罐中,用時取出培養複蘇。農業部獸醫藥品監察所和國家衛生部生物藥品檢驗所均保存有多種傳代細胞係和二倍體細胞株,對外實行有價供應。傳代細胞係的培養方法基本相同。各種人工綜合營養液和乳白蛋白水解物均可用作營養液的基礎。1)豬腎傳代細胞:在現有的一些豬腎細胞株中,既有經過嚴格鑒定並低溫保存的二倍體細胞株,也有已經發生惡性變,喪失原來正常的二倍體組型而成為所謂異倍體的傳代細胞係。但是它們的營養液和傳代方法基本相同。取已長成單層的豬腎細胞,傾棄原來的營養液,最好再用Hanks液等衝洗一次。加入002%EDTA溶液或05%胰酶和004%EDTA溶液的等量混合液,其加入量以能在單層細胞上形成1mm厚的液層為宜。置室溫或37℃溫度中消化5～30分鍾(隨細胞種類而不同),當細胞層開始由瓶壁剝離時,即可將消化液傾出,並加入少量營養液,輕晃衝洗細胞層後傾棄,再加相同於原營養液量的新營養液,以大口吸管充分吹打,直至細胞完全分散,再加同量營養液,吹打數次後即可分瓶。為便於吹打和分散細胞,開始時可少加一些營養液,吹打分散後,再逐步追加營養液至所需量。其分種率為1∶2,即由1瓶傳為2瓶。有時分種率可提高到1∶3或1∶4。第2～4天換液,在快長成單層時接種病毒。生長液為E〖DK〗MEM與05%乳白蛋白水解物的等量混合液(也可分別單獨使用),內含抗生素和10%犢牛血清,pH72。維持液的成分相同,僅其血清含量減少至5%或2%,並提高pH至76。2)Vero細胞:它是一種獸醫病毒學實驗室應用較多的細胞,不僅對多種病毒敏感,而且容易培養,增殖快速,性質穩定。培養傳代時,取已形成單層的細胞培養瓶,傾棄維持液,用Hanks液洗2～3遍後,加入025%胰酶溶液,加入量約為原營養液量的1/3,室溫或37℃水浴消化,待細胞麵開始脫落時,即可翻轉培養瓶,並傾去大部分胰酶溶液後,再行翻轉培養瓶,讓殘留胰酶溶液繼續呈現消化作用,並如上加入新營養液,吹打和分裝。細胞生長良好時,可以1∶3的比例進行傳代,即1瓶傳3瓶(每ml含細胞30～40萬)。生長液為〖DK〗EMEM與05%乳白蛋白水解物的等量混合液(也可分別單獨使用),內含10%犢牛血清,pH72。維持液的成分同上,但血清含量減半(或減2/3),pH提高至74～76。3)白紋伊蚊C6/36細胞:這種細胞很容易生長,並對多種蟲媒披膜病毒敏感。取已形成單層的細胞培養瓶,傾棄營養液,用Hanks液洗1～2遍,加入約原液量1/3的E〖DK〗MEM綜合營養液(pH68),然後用大口吸管吹打,使瓶壁上的單層細胞脫落並分散為單個細胞。最後按原營養液量的4倍補足營養液,混勻,分裝為4瓶(即1瓶傳4瓶)。培養瓶置28℃培養。每周傳1代。④微量培養板培養和轉瓶(管)培養:這兩種培養均屬於單層細胞不同的培養形式,扼要介紹如下。1)微量培養板培養:是60年代開始應用的。各種細胞尤其是傳代細胞係在微量培養板上能獲得良好生長。微量法的優點不僅是節省材料,而且能增多重複試驗的份數,提高實驗結果的準確性。可應用於病毒分離、毒力滴定、中和試驗、熒光抗體和酶聯免疫吸附試驗等。但微量法對原代細胞培養的效果較差,尤其是血液巨噬細胞。微量培養板為塑料製品(帶蓋),每板含不同數量培養孔,以40孔、96孔的多用。每孔容積為03～05ml,加入的培養液量為其容積的1/3～1/5(一般為01ml)。孔底有平麵和球麵兩種,如需鏡檢以平底為宜。目前多應用國產聚苯乙烯微量培養板。將稀釋好的細胞懸液,用定量移液管或微量滴管向每孔加入01ml,加蓋後置5%CO2溫箱內培養。24～48小時後用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況,如已長成或基本長成單層,即可換液接毒。微量培養應著重注意以下幾點:首先是要掌握好接種的細胞數,不宜過多,以每孔接種1～2萬個細胞為宜;其次是血清質量要好,而且要適當加大營養液中的血清含量,可較一般培養提高約50%;再次是要認真搞好培養板的消毒處理,準備工作周到,操作快速準確。如無CO2溫箱,可在滴加細胞懸液後立即用透明膠紙帶密封整個培養板的表麵,防止孔中營養液蒸發、變堿或汙染。也可在將微量培養板加蓋後,用普通的橡皮膠布密封其四周,並置於點燃蠟燭的幹燥器內(可產生5～10%的CO2)。2)轉瓶(管)培養:使貼壁的單層細胞並不始終浸泡於培養液中,有利於細胞的新陳代謝,從而獲得更為旺盛增殖的細胞。特別是轉瓶培養能充分利用整個瓶壁表麵,使其長滿細胞單層,能生產出高效價的病毒製品。作大量細胞培養時,常用1萬ml優質細口圓立瓶,每瓶接種細胞懸液1000～1500ml,混勻,放轉瓶機(每小時轉8～10周)上培養,24～48小時後用特製顯微鏡觀察細胞生長情況,如已長成或基本長成單層,即可換液接毒,當然也可在細胞培養當時同步接毒。轉管培養應用特製的自動旋轉鼓,將培養管放入鼓孔中,將鼓置37℃培養。旋轉鼓適於多管小量培養,用作某些病毒的分離和鑒定等。(2)懸浮細胞培養:為能獲得大量均勻生長的細胞懸液,早在20多年以前,人們就已開始探索細胞懸浮培養的方法。最先是用旋轉瓶或旋轉鼓,以每分鍾40～50轉的速度強使細胞不能貼壁而呈懸浮生長。後來又改用攪拌的方法,使細胞維持在懸浮狀態。一般來說,活細胞都有可能在懸浮狀態下生長。但是必須指出,同一株細胞中的某些細胞可能更加適應懸浮培養,例如Parker的實驗室曾從猴腎細胞培養物中選育出一株可在靜置培養條件下自發地呈懸浮生長的細胞株,也曾有人從L細胞和HeLa細胞中選出自發的懸浮株。近年來廣泛應用於口蹄疫疫苗生產的乳倉鼠腎傳代細胞株BHK〖DK〗21克隆13,也是一株適於懸浮培養的細胞株。但原代細胞和二倍體繼代細胞都難以在懸浮狀態下生長。由於大規模培養哺乳類動物細胞是生產多種生物製品的重要方法,近年來很多先進國家都投入了巨額的資金和人力,重點設計研究在各種不同懸浮狀態下大量培養細胞的設備和方法,成為新興的細胞工程的一個重點開發方向,新設計的各種培養罐不僅完全自動化,而且容量大的已超過1萬升。當前這方麵研究處於領先地位的是英國Celltech公司研製的全自動、密封的氣升式深層培養係統。其原理是,混合氣體自培養罐底管道進入,順中央內管上升,部分氣體從罐頂逸出,另一部分氣體沿管內緣下降,直達罐底和新吹入的氣體混合後再度上升。就這樣借助氣體的不斷上下循環攪動營養液,不使細胞貼壁。整個操作都由電子計算機程序控製。種入細胞後培養3～4天,每ml細胞數可達25106個以上。細胞懸浮培養時,必須掌握下列幾個關鍵問題。①由於細胞生長旺盛,每ml營養液負擔的細胞密度明顯高於單層培養細胞,因此,氧和營養成分的供應必須十分充足。一般應用雙倍濃度的氨基酸和維生素,例如2倍濃度的E〖DK〗MEM,另外添加血清和細菌培養用蛋白〖HT5,7SS〗月〖KG-*4〗〖HT5,7SS〗示〖HT〗等營養補充劑,而且經常是在培養過程中多次追加新的營養液,以保證細胞生長代謝的需要。空氣由自動控製裝置經濾器過濾後輸入。營養液的酸堿度,由pH自動調節器調節二氧化碳輸入量控製。②為保證所有細胞都能獲得足夠的氧和營養成分,也是為了避免細胞沉澱,培養液必須處於快速攪拌狀態下,一般是每分鍾攪拌300～500次。同時可在營養液內添加少量甲基纖維素,增高營養液的粘度,以利細胞保持在懸浮狀態下生長。③由於細胞在迅速增殖以前,必須先對營養液作“條件化”改變,隻有這種“條件化”了的營養液才能保證和促進細胞大量增殖。因此,開始接種時的細胞數需有足夠的濃度,以利細胞對營養液進行“條件化”。一般的做法是在開始接種時少用一些營養液,使接入細胞具有較高的濃度,當細胞增殖達一定數量時,再行加入全部營養液。④不言而喻,細胞培養罐的所有部分,特別是各個部件和裝置的接頭部分和傳動部分,必須嚴格密閉,以免發生細菌和黴菌性汙染。⑤細胞培養過程中,必須定期采樣,進行細胞計數,並測定細胞活力,計算活細胞在細胞總數中的百分率,一般要求至少在90%以上。具體有兩二種方法:1)用去離子水配成2%台盼藍溶液,以1500r/min的速度離心沉澱10分鍾,吸取上層液作為染色液。於1ml待檢細胞懸液中,加入05ml染色液,混合後進行計數,活細胞不著色,死細胞則被染成藍色;2)用去離子水配成1％中性紅溶液備用。計數細胞時再用Hanks液稀釋10倍,以1500r/min的速度離心沉澱10分鍾,吸取上層液作染色液。於08ml待檢細胞懸液中加入02ml中性紅溶液,混合後置室溫感作15～20分鍾後計數,活細胞吸收中性紅呈紅色,死細胞不著染。(3)微載體細胞培養:利用微載體培養動物細胞是1967年VanWezel首先創立的。其原理是利用對細胞無毒性的微小顆粒,按一定比例放入混懸培養的營養液中,作為細胞附著增殖的載體,從而顯著擴大細胞長成單層的附著麵,充分利用生長空間和營養液,達到大大提高細胞產量的目的。微載體培養的細胞既在載體表麵形成單層生長;但為了不使載體沉澱,又要不斷攪拌,使載體保持懸浮狀態。可見微載體培養是單層細胞培養與懸浮培養相結合的方法。當前利用微載體已成功地培養了上百種動物細胞,其中不僅傳代細胞係,而且能使懸浮培養不能生長的很多原代細胞和二倍體細胞良好生長,其單位容積的細胞產量比一般單層細胞培養高10倍,甚至幾十倍。因此微載體法應用前景廣闊,不僅可用於生產疫苗、病毒抗原、幹擾素和單克隆抗體等,也是生產基因重組產品的重要手段。據有關實驗資料,多種病毒均可適應微載體細胞培養,尤其是某些在常規方法生長不佳的病毒,可用此法獲得改善。曾有一則豬瘟病毒微載體的培養報道:在200ml營養液中加入1支CytodexⅢ微載體,PK15細胞在8小時培養後全部貼壁,細胞總量達54×107,相當於9個表麵積為175cm2培養瓶所獲的細胞量。接種豬瘟弱毒Alfort187株後48小時,毒價高達1092TCID50/ml,較常規法的病毒產量高出10倍以上,而且還能節省大量的營養液和血清。微載體培養的關鍵是微載體和相應的帶攪拌的特製培養裝置。微載體是用對細胞無毒性的葡聚糖等材料製成的可供細胞貼壁生長的微粒,幹燥的微粒直徑40～150μm,浸泡營養液後膨脹到60～250μm,既小又輕,表麵積大,在1ml營養液中5mg微粒的總麵積可達30cm2,因此能獲得很高的細胞產量。另外還有一類用無毒性聚苯乙烯為原料製成的微載體,直徑160～300μm,它的特點是在液體中不膨脹。目前商品化的微載體種類很多,國產的如CT1、CT3、GT2(華東化工學院)、MC1(軍事醫學科學院),進口的如CytodexⅠ、Ⅱ、Ⅲ,Biocarrier,Gelibead以及DEAE纖維素和以聚苯乙烯為原料的Biosilon等。據實驗資料報道,當前應用較多效果較好的是瑞典產的CytodexⅠ、Ⅱ、Ⅲ型微載體(其次是丹麥產的Biosilon微載體)。使用前用蒸餾水泡脹,1g幹載體加50mlPBS懸浮,高壓滅菌後保存於普通冰箱中備用。1gCytodexⅠ約提供06m2細胞貼附麵積,其密度為103g/ml。微載體培養的細胞密度:傳代細胞係一般約為2×105個細胞/ml,但原代細胞和二倍體細胞株應適當加大細胞密度。微載體濃度一般為1mg/ml,為了提高細胞產量,有時可提高到每ml含3～5mg。將加完細胞和微載體的培養瓶(帶磁攪拌棒,有的帶有通氣裝置)放在特製瓶架上,置37℃培養,攪拌棒的轉速每分鍾約60～80轉。通常經6～8天,載體表麵即可長出致密的細胞層,用維持液洗兩次後,換液接毒。進行微載體大量細胞培養時,目前多應用懸浮細胞培養瓶或發酵罐,自動調節pH和通氣(最適氧壓160mmHg),最高細胞產量已達2×107個細胞/ml。近年美國Bellco公司設計出一種新型大載體培養係統,專供大規模培養細胞應用。這種大載體是由海藻酸鈉構成的,它在鈣溶液中形成適於細胞附著的網絡狀凝膠珠。大載體培養係統設備複雜,隻適用於大型實驗室和生物製品廠。(4)無血清培養:無血清營養液可用於單層和懸浮細胞培養等各種培養方法。從培養細胞類型講,無血清營養液雖可用於培養原代細胞、二倍體細胞和傳代細胞,但以後者易於成功,目前這種培養方法主要用於傳代細胞係。無血清營養液培養的關鍵是選擇適宜的營養液和細胞。①營養液:不同種類的細胞對營養液的成分有不同的要求,不可能用一種營養液配方培養多種細胞。自行配製營養液時,需要通過培養實驗確定添加物的種類和數量。可見這是一項比較複雜費時費事的工作。但目前已經有了便利條件,即市場上已能買到適於培養多種細胞的無血清營養基。可根據培養細胞的種類選擇適宜的培養基配成營養液進行培養,也可通過實驗從幾種不同配方中選擇出最適於該種細胞的營養液。②細胞:現在應用無血清營養液培養成功的細胞係已經不少,不下幾十種,其中有:MDCK(犬腎上皮細胞),Hela(人子宮頸癌細胞),BHK(乳倉鼠腎細胞),GH3(大鼠腦垂體癌細胞),B104(大鼠神經母細胞瘤細胞),M2R(黑色素瘤細胞),C6(大鼠神經膠質瘤細胞),MCF7(人乳腺癌細胞),ZR75〖DK〗1(人乳腺癌細胞),F9(小鼠胚胎癌細胞),TM4(小鼠睾丸上皮細胞),HC84S(人結腸癌細胞),L6(大鼠肌母細胞),HLE222(人肺鱗癌細胞)和RF1(大鼠卵巢濾泡細胞)等。而且有些細胞係如ZR75〖DK〗1,HC84S和HLE222,它們在無血清培養液中的生長比在有血清培養液還好。HC84S細胞係在無血清培養液中能維持高密度分化狀態,並形成絨毛樣分泌結構。培養時選用上述細胞係尤其是已適應於無血清培養液的細胞,則更容易成功。需要指出的是,一般傳代細胞從它已經適應的含血清營養液,轉換為無血清的營養液,往往不是一下子能改變得了的,要有個逐漸適應過程。轉換初期,營養液可由原含血清營養液和無血清營養液1∶1組成。根據細胞的適應程度,逐步減少原營養液比例,直至完全用無血清營養液所取代。

 

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