雞胚(包括其它禽胚)是正在 發 育中的機體,多種動物病毒能在雞胚中增殖和傳代,並可用雞胚製備某些病毒抗原、疫苗和卵 黃抗體等。禽胚的優點在於胚胎的組織分化程度低,又可選擇不同的日齡和接種途徑,病毒易 於增殖,感染病毒的組織和液體中含有大量病毒,容易采集和處理,而且來源充足,設備和操作 簡便易行。應用雞胚需要注意的首要問題是胚內可能汙染細菌(如沙門氏菌等),尤其是經母 雞垂直傳遞的病毒,如禽白血病病毒以及新城疫、禽腦脊髓炎和Rous肉瘤病毒等。另外,胚胎 中往往含有因母雞免疫而產生的卵黃抗體,影響同種病毒的增殖。因此理應選用SPF雞群產的 蛋。雖然喂飼添加抗生素飼料母雞的蛋中含有抗生素,但對病毒學實驗通常無影響。病毒在 雞胚中增殖,除部分病毒產生痘斑、引起充血、出血、壞死灶和死亡等變化外,許多病毒缺 乏特異性的感染指征,必須應用血清學反應或檢查病毒抗原以確定病毒的存在。雞胚實驗 必需的器械主要有孵卵箱、檢卵燈、卵盤、開卵鑽、卵杯和羊膜腔接種用的照明燈等。操作 時要注意防止汙染,選擇適宜的接種途徑和培養溫度,並要認真觀察,及時收獲。雞蛋孵育 前不要洗擦,因洗擦能除掉卵殼表麵的膠質保護層,容易致發細菌感染。沒有孵卵箱時,也可 用普通恒溫箱代替,為保持40%～70%的相對濕度,於其下部應放一盛水盤。最適溫度為38～39 ℃,並應每天翻卵1～2次。現扼要介紹常用的絨毛尿囊膜、尿囊腔、卵黃囊和羊膜腔等四 種接種方法(圖11-1)。〖JZ〗圖11-1 雞胚接種的途徑
1.絨毛尿 囊膜接種〖HT5SS〗主要用於痘病毒和皰疹病毒的分離和增殖,這些病毒可在雞胚絨毛尿囊膜上形 成痘斑或病斑。用10～12日齡雞胚,在胚胎附近略近氣室處,選擇血管較少的部位,用電烙器 在卵殼上烙出一個直徑約3～4mm的烤焦圈,用碘酊和酒精消毒後,小心用刀尖撬起卵殼,造成 卵窗,但不可損傷殼膜。在氣室端中央也鑽一個小孔。隨後用針尖輕輕挑破卵窗中心的殼膜, 切勿損傷其下的絨毛尿囊膜。滴加1滴滅菌生理鹽水於剌破處。用橡皮乳頭緊貼於氣室中央 小孔上吸氣,造成氣室內負壓,使卵窗部位的絨毛尿囊膜下陷而形成人工氣室,此時可見滴加 於殼膜上的生理鹽水迅速滲入。用1 ml注射器滴入2～3滴接種物於絨毛尿囊膜上。最後用透 明膠紙封住卵窗,或用玻璃紙蓋於卵窗上,周圍塗以熔化的石蠟密封之。氣室中央的小孔可用 石蠟密封住。雞胚在接種後,橫臥於孵卵箱中,不許翻動,保持卵窗向上。絨毛尿囊膜接種 的另一種方法是在氣室端的卵殼上開約15cm×15cm的口,並小心地用滅菌眼科鑷子撕去 一小片內殼膜,切勿損傷其下的絨毛尿囊膜,隨即滴入接種物,最後用透明膠紙封閉開口。
2.尿囊腔接種 主要用於正粘病毒和副粘病毒,例如流感病毒和新城疫病 毒的分離和增殖,也是製備馬 腦炎病毒疫苗的常用接種途徑。選用10～11日齡的雞胚,畫出氣室和胚位,在氣室接近胚位處 塗抹碘酊和酒精進行消毒後,用鋼錐穿一小孔,隨後將注射器針頭沿此小孔插入05～10cm 處 (避開血管),注入01～02ml接種物。最後用石蠟封口,並置孵卵箱中孵育。每天翻卵並檢 卵 一次。24小時內死亡者廢棄。但如上述,東方型和西方型馬腦炎病毒常可在接種後的15～24 小時內致死雞胚。另一個方法是在胚位附近沒有血管處穿孔並注入接種物,但此時必須將 氣室端稍向下傾,否則接種液甚至尿囊液可能從針孔中回溢出來。蠟封的方法同前。
3.卵黃囊接種主要用於蟲媒披膜病毒以及鸚鵡熱衣原體和立克次氏體等的分離和增殖。用6～ 8 日齡雞胚,畫出氣室和胚胎位置後,垂直放置在固定卵座上,用碘酊和酒精消毒氣室端,以鋼 錐在氣室中央錐一小孔,用滅菌注射器吸取含病毒懸液,沿氣室端所穿小孔剌入約3cm,注入0 1～05ml接種物於卵黃囊內。隨後用溶化的石蠟封孔,置孵卵箱內繼續孵育,每天翻卵1～2 次 。24小時內死亡者廢棄,但東方型和西方型馬腦炎病毒可能在接毒後15～24小時內致死雞胚 。
4.羊膜腔接種主要用於正粘病毒和副粘病毒的分離和增殖。在由病料初次分離病毒時 ,羊膜腔接種法比尿囊腔接種法敏感。但此法操作技術比較困難,雞胚也易受傷致死。選用11 ～12日齡的雞胚,按絨毛尿囊膜接種法造成人工氣室,撕去卵殼,並剌破絨毛尿囊膜血管較少 的部位,用鈍端鑷子沿此破孔插入,夾起羊膜囊,注入01～02ml接種物。由於不易判斷接 種 物是否被正確地注入羊膜腔內,故可將已經吸取了接種物的注射器的筒栓稍微回抽,使注射針 芯內含一個氣泡。注射時將氣泡和接種物一起注入。將卵適當倒轉,即可清楚地看到氣泡是 否 在羊膜腔內,以判定注射是否正確。另一個方法是在氣室端中央開一個12cm直徑的圓孔 。 用滅菌鑷子揭去卵窗部位的卵殼和殼膜,並滴加1滴滅菌液體石蠟於內層殼膜上,使其透明。 如置檢卵燈上觀察,看得更加清楚。隨後用滅菌彎頭眼科鑷子,剌破內層殼膜和絨毛尿囊膜( 避開血管!)並輕輕夾起羊膜使成傘狀,並在直視下將注射針頭插入羊膜腔內,直到碰著雞胚或 看到胚胎突然向後退縮,證明針頭已經到達羊膜腔內,即可進行接種。接種病毒後的雞胚, 一般放37℃孵育,也有少數病毒如流感病毒則放置於33～35℃。除接種馬腦炎病毒外,在24小 時內死亡的雞胚均視作非特異死亡而廢棄。培養時間也隨病毒種類而異(參見病毒各論)。根 據接種途徑的不同,收獲相應的材料:絨毛尿囊膜接種者,收獲接種部絨毛尿囊膜並注意觀察 病變;尿囊腔接種者, 收獲尿囊液(5～8ml),並於收獲前將雞胚直立放置於4℃冰箱半小時以 上,凍死胚胎,防止出血;卵黃囊接種者,收獲卵黃囊或胚體;羊膜腔接種者,收獲羊水(05～1 ml)。獸醫病毒學實驗中,除常用雞胚外,有時也用鴨胚、鵝胚、火雞胚和鵪鶉胚等進行病 毒分離、弱毒株培育、疫苗製造以及卵黃抗體生產等。鴨和火雞的孵化期為28天,比21天孵 化期的雞胚更有利於慢病毒的增殖。
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