抗病毒感染育種

抗病毒感染育種

動物抗病毒育種包括兩個方麵的內容：一是應用常規育種技術，篩選自然存在的 抗病個體或 品係，通過有計劃的選配和選育，培育一些抗病毒動物新品係；二是采用基因工程手段，即 是利用DNA重組技術，克隆和構建抗病毒基因，並通過轉基因手段導入動物種係染色體內 ，構建轉基因動物，再結合常規育種技術，培育抗病毒動物新品係。[BT3](一) 常 規抗病毒感染育 種常規抗病毒育種技術已在家禽實踐上取得了一定的成功。雞馬立克氏病(MD) 是雞最常見的淋巴 組織增生性疾病，本世紀三十年代在全世界養雞地區廣泛流行，危害嚴重，隨後有所平熄。 到了六十年代初，強毒力的馬立克氏病病毒再度出現並廣泛流行。分析馬立克氏病流行特點 後發現，雞體的遺傳結構與馬立克氏病的易感性密切相關，在遺傳上對馬立克氏病毒具有較 大抵抗力的雞，還具有成熟早、產蛋高等特點。通過抗病育種篩選，可以達到通過遺傳控製 疾 病的效果。Hutt和Cole在三十年代初開始的工作，奠定了遺傳選擇控製疾病的基礎。不同 品係雞間在馬立克氏病易感性方麵存在著很大的差異。現已人工選育並維持了幾個對馬立克 氏病(ND)具有遺傳抵抗力的品係。選育方法有兩種，其一是利用後裔檢測法或用感染種雞群 的幸存者進行繁殖，培育的抗病品係中易感雞少於5%，而未經選育群體中易感雞達50%以上 。 國內李康然(1993年)已建立了500羽的抗病核心群。另一種選育方法以血型為基礎，依賴於M D抵抗力與B21之間的密切相關。由於免疫雞群與非免疫雞群對MD的抵抗力改變並不 完 全一致，有人建議抗MD雞群的選育應在免疫雞群中進行，但目前的選育工作多是在非免疫雞 群中開展。雞白血病/肉瘤是由禽反轉錄病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的總稱，這類疾 病 的發生與宿主的基因組成有關。在人工選育時，未知父母代的基因型可以通過其子代與設定 亞群呈隱性的試驗雞進行交配，根據特殊的交配試驗中易感性和抵抗性子代的分離，即可確 定未知父母代的基因型。子代表型的鑒別，可以經過尿膜接種勞斯肉瘤病毒(RSV)進行痘斑 計數將雞胚分為易感性和抗性雞胚或將RSV接種雛雞顱腔內，根據死亡存活計數率劃分。 由 於抵抗力可能是由多基因控製的，因此這一方法尚未推廣。[BT3](二) 基因工程抗病 毒感染育種 [HT5SS]基因工程抗病毒育種是近年來提出的新設想，是預防獸醫學研究的國際前沿領 域，具有十 分重要的學術意義和發展前景，有著巨大的潛在經濟效益。基因工程抗病毒育種可分為 二 個階段：首先構建轉基因動物，然後以轉基因動物為親本進行常規育種。目前應用的抗病毒 基因主要有如下幾類。[BT4]1.抗病毒細胞因子及其相關物質的 基因(1) 細胞因子基因：幹擾素(IFN)、白介素(IL)等是動物體內的生物活性因子，它們 具有抗病毒、抗腫 瘤及免疫調節等功能。將這些具有抗病或抗病相關物質的基因，經體外克隆和構建，導入動 物的受精卵內，有可能培育成功具有病毒抗性的轉基因動物。目前，IFN轉基因動物的培育 研究已在國內外相繼獲得成功，IL也於轉基因鼠體內產生了明顯的生物學效應。(2) Mx蛋 白基因：Mx蛋白是由IFN誘導產生並具有明顯抗病毒活性的胞內蛋白。Arheiter等將小鼠Mx1 蛋白的cDNA置於IFN或病毒誘導性啟動子的控製下，導入對流感病毒敏感的小鼠受精卵內 ，獲得的轉基因小鼠可以抵抗高劑量甲型流感病毒的攻擊。(3) IFN受體基因：IFN通過與 細 胞表麵相應受體結合，誘導細胞產生抗病毒蛋白而實現其抗病毒作用。研究表明，αIFN 和β－IFN通過同一受體與細胞相結合，因此，可以通過增加機體細胞表麵受體數量， 充分發揮IFN的間接抗病毒作用。Lutfalla等已經克隆獲得人的α－IFN受體基因，並在小鼠 細胞表麵實現表達。研究結果證明，它與α－IFN和β－IFN具有很高的親和性。將該基因導 入動物 受精卵， 有可能培育成功IFN高反應性的轉基因動物——通過IFN受體介導增強動物的抗病 毒能力。[BT4]2.病毒結構蛋白基因應用病毒衣殼蛋白基因進行抗病毒轉基因研究，最初報道 於植物。Abel等培育成功了攜帶花葉病毒衣殼蛋白基因的轉基因煙草植株，這些轉基因植株 均表現出延遲發病的抗病性。Beachy對抗病機製作了探討，認為轉基因植物阻止了病毒RNA 的釋放與表達。在動物病毒研究方麵，尚未見有關類似成功的報道。但Sambrook等將流感 病毒血凝素(HA)基因導入小鼠受精卵，在小鼠的胰β細胞表麵HA獲得表達。病毒攻擊後 ，轉基因小鼠產生高滴度的抗HA抗體，說明機體並未產生對HA的免疫耐受。它提示我們，利 用病毒保護性抗原基因有希望培育出抗病毒的轉基因動物。[BT4]3.病毒中和性單克隆抗體基因 抗體的可變區是與相應抗原進行特異結合的部位，即抗體的活性部位。將抗病毒中和性單克 隆抗體的可變區基因通過反轉錄途徑進行克隆，構建表達該區的重組基因，能夠表達該單抗 的有效成分用於治療。如果將該基因導入動物受精卵中進行種係轉化，培育含該基因的轉基 因動物，也將為抗感染育種提供一條新途徑。在這方麵，Ye等克隆了抗狂犬病病毒中和性 單 抗可變區基因的研究已初獲成功。[BT4]4.反義RNA反義RNA最初發現於原核生物，它們以自然存 在的方式，通過堿基配對，特異性地與mRNA結合，阻止mRNA的翻譯，是存在於原核生物中 的 一種基因表達調控因子。後來，在真核細胞中也發現了一些類似反義RNA作用的RNA小分子。 通過基因轉移技術證實了反義RNA在真核細胞中有抑製或 關閉mRNA翻譯的功能。研究表明，病毒RNA的不同部位均有一定程度的反義抑製作用。因而 針對不同病毒的基因結構和調控序列設計相應有效的反義表達質粒，就可實現抑製病毒的目 的。反義核酸抑製病毒複製的試驗雖在培養細胞獲得成功，但仍少見應用於植株和整體動 物的報道。據有關資料介紹，美國一家公司將合成的反義PG(聚乳糜酶)基因轉化西紅柿植株 ，其結出的西紅柿不易軟化，有利於保存和運輸。另據介紹，美國研究人員正從事應用反義 抑製技術培育抗白血病轉基因鼠的研究，並已獲得初步成功。我們也證實了抗豬瘟病毒反義 RNA在培養細胞上對豬瘟病毒的抑製作用並正在開展轉基因家兔和轉基因豬的研究。 可見，應用 反義RNA進行抗病育種研究，是一個很有價值的探索領域。[BT4]5.RibozymeRibozy me可譯為 核酶，有人稱之為基因剪刀，它是一種天然的RNA小分子，這種RNA小分子具有催化RNA切割 反應的功能，可以序列特異性地切割RNA。研究表明，Ribozyme具有決定其切割反應特異性 和切割活性的結構，它們與靶RNA具有對應關係。因此，隻要已知的某種病毒的RNA序列， 就可以設計並合成相應的抗病毒Ribozyme，體外試驗結果表明，人工合成的Ribozyme能夠切 斷動物病毒的RNA。目前澳大利亞CSIRO的研 究人員已經設想通過Ribozyme開展培育抗病毒轉基因動物。Ribozyme抗豬瘟育種在我國也已 開展。看來Ribozyme在抗病毒育種方麵也有潛在的應用前景。[BT4]6.MHC等位基因即主要組織相容性抗原複合體基因。MHC基因是參與調節機體免疫反應的基因群，其中 很多等位基因與病毒性傳染病的抗性有關。根據MHC基因的表達產物的性質與功能不同，可 將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類抗原。其中Ⅱ類抗原主要存在於巨噬細胞和B細胞表麵，是T細胞的激 活因子，尤其是巨噬細胞表麵的Ⅱ類抗原，當其與經巨噬細胞降解的病原體分子結合後，形 成T細胞的第一激活信號，從而啟動細胞和體液免疫反應。動物在感染病毒後，能否發生免 疫反應，主要決定於Ⅱ類抗原識別病毒抗原分子，並與之結合的程度。有些動物對某種病原 特別易感，原因之一就是缺乏相應的Ⅱ類抗原。雞的MHC(即B)編碼基因組分為B－F、B－G和 B－ L三段：其中B－F編碼Ⅰ類抗原；B－L編碼Ⅱ類抗原；B－G為禽類所特有，編碼Ⅳ類抗原， 存在 於紅細胞等多種細胞表麵，參與免疫調節。最近的研究表明，B－G和B－F都與雞馬立克氏病 ( MD)的抗性有關。人們正在試圖以具有天然抗MD的B21/B21雞為研究對象，鑒定和分離抗MD基 因。由於基因操作技術的不斷發展，目前可以將兩個或多個抗病毒基因克隆至同一載體中。將這 樣的多重抗病毒基因導入動物體，能使不同抗病毒功能的基因產生協同作用。如將反義RNA 和Rib ozyme融合在一起，既可阻止病毒RNA的翻譯，又可將病毒RNA切斷，從而大大增強其抗病毒 作用。又如將Mx基因與中和性單抗可變區基因融合在一起，不僅可以發揮單抗可變區的胞外 0抗病毒作用，而且可以發揮Mx的胞內抗病毒作用。同樣，反義核酸與中和性單抗可變區 基因融合，既有核酸水平的抗病毒作用，又有蛋白水平的作用。總之，隨著胚胎學、分子生 物學和基因工程技術的不斷發展，抗病毒感染育種研究將不斷深入並取得進展。