病毒誘變因素及其誘變機理

從整個遺傳學的角度而言，人們對變異的認識是從自發突變開始的。自發突變的原因目前尚不清楚，可能是外界因素和內部因素共同作用的結果。1927年Muller用X射線處理果蠅精子，證明可誘發突變，顯著提高突變率，從此開始了人工誘變研究的曆史。在病毒方麵，人工誘變最先成功於煙草花葉病毒，隨後對痘病毒、新城疫病毒、偽狂犬病病毒、脊髓灰質炎病毒等動物病毒進行人工誘變試驗，亦獲成功。如果配合應用選擇條件和病毒純化措施，使原種的增殖受到抑製，一般都能較快獲得突變株。 能夠引起或促進病毒變異的各種理化學因子，嚴格地講還應包括生物學因子，通稱為誘變因素或誘變劑。紫外線、X線和γ射線等物理因素可擾亂或破壞病毒核酸的正常結構而使病毒滅活或導致突變(詳見本書第五章)。生物學因子主要指病毒感染之後，在宿主體內產生的各種免疫學因子，如免疫球蛋白、幹擾素和各種細胞因子等。其中免疫球蛋白，即特異性抗體，可能有著特殊意義。使病毒在免疫動物或免疫人體中連續傳代，或者應用次中和量的免疫血清與病毒混合，在雞胚或培養細胞內多次傳代，一般都能較快獲得抗原變異株。如上述，流感病毒和口蹄疫病毒等的抗原自然變異，可能也是病毒在部分免疫的人群或畜群中周轉的結果。而新的變異株的形成，又將引起新的流行，進而改變人群或畜群的免疫狀態，反過來又促進新的變異的產生，有關內容請參閱本書各論部分。這裏主要論述在人工誘變中最常用的化學誘變劑。 化學誘變劑大致可以分為兩大類，下麵分別加以敘述。 [BT4]1.在病毒增殖過程中呈現作用的誘變劑 主要指各種嘧啶和嘌呤的類似物，前者包括5溴尿嘧啶(5BU)、5氟尿嘧啶(5FU)、5溴脫氧尿核苷(5BUDR)和5氟脫氧尿核苷(5FUDR)，後者如2氨基嘌呤(2AP)。這類誘變劑在病毒核酸合成過程中替代某些正常堿基而進入核酸結構，部分病毒因而滅活，另一部分病毒則因此而發生突變。丫啶類化合物，如原黃素以及丫啶橙等，則是由於能夠插入鄰近兩個嘌呤之間，在核酸複製時造成堿基增加或缺失的錯誤導致變異。 現以5溴尿嘧啶和2氨基嘌呤為例，說明嘧啶和嘌呤類似物的誘變機理。胸腺嘧啶的甲基被一個溴原子代替，就是5溴尿嘧啶，兩者在結構上十分相似。正常情況下胸腺嘧啶的6位上是一個酮基，所以能和相對位置上的腺嘌呤的氨基形成氫鍵。胸腺嘧啶也可以另一互變異構形式(烯醇式)出現，但在生理條件下，酮式占絕對優勢。5溴尿嘧啶5位上的溴原子改變了酮式和烯醇式之間的平衡關係，使較常出現烯醇式，烯醇式的5溴尿嘧啶不能與腺嘌呤形成氫鍵，卻能與鳥嘌呤形成氫鍵。5溴尿嘧啶代替胸腺嘧啶(T)與腺嘌呤(A)配對，其結果，正常的A-T配對變為A-BU(圖6-7左)。當5溴尿嘧啶由酮式狀態轉變為烯醇式狀態時，則與鳥嘌呤(G)配對而成G-BU(圖6-7右)。最終使原來的A-T轉換成G-C(A-T→G-C)。同樣地，如果DNA分子的某一位置有一對堿基G-C，在複製時5溴尿嘧啶代替了C而摻入，經過兩次複製就在該位上出現一對A-T (如圖6-8)。[HT5”SS][JZ]圖6-7 左：5BU酮式.和A配對；右：5BU烯醇式.和G配對 [HT5SS][HT5”SS][JZ]圖6-8 左：A-T→G-C；右：G-C→A-T[HT5SS]　　2氨基嘌呤是腺嘌呤結構的類似物，能與胸腺嘧啶配對，但也可以呈現亞氨基形式而與胞嘧啶配對，因此也可誘發A-T→G-C轉換。 [BT4]2.對病毒核酸直接呈現作用的誘變劑 根據化學性質和具體呈現的作用，又將這些物質分為幾個類別，分述如下： (1) 非烷化劑類：包括甲醛(HCHO)、羥胺(H2NOH，HA)、甲羥胺(H2NOCH3 )，MHA)、亞硝酸、重硫酸鹽(HSO3)和肼(H2NNH2，HZ)，如圖6-9所示。[HT5”SS][JZ]圖6-9 非烷化類誘變劑的結構[HT5SS]　　甲醛可與核酸中的氨基發生可逆反應。這種反應呈很強的構象依賴性，即主要作用於單鏈核酸。甲醛與核酸的A、G、C反應形成羥甲基衍生物(圖6-10)；另一方麵，用甲醛處理RNA後可產生CH2交聯體，這是甲醛引起的第二種較緩慢的反應(圖6-11)。 [HT5”SS][JZ]圖6-10 非烷化劑與核酸和核苷酸的反應產物[HT5SS][HT5”SS][JZ]圖6-11 誘變劑引起的交聯反應[HT5SS]羥胺和甲羥胺可與A、C和U反應，其中與U反應導致產生糖基脲而使之滅活(最適pH10)，與C 或A反應(最適pH5～6)導致氨基被羥氨基(NHOH)或甲羥氨基(NHOCH3)取代(圖6 -10)。 亞硝酸是傳統的氧化脫氨基試劑(NH2→OH)，曾被認為是完美的誘變劑。經脫氨基作用後腺嘌呤(A)變為次黃嘌呤(HX)，鳥嘌呤(G)變為黃嘌呤(X)，胞嘧啶(C)變為尿嘧啶(U)。當A→HX時，由於HX在核酸複製過程中優先與C配對，所以使A-T變成G-C，發生了A→G和T→C轉換(圖6-12A)。當C變成U時，因U優先與A配對，所以使G-C變成AT，發生了G→A和C→T轉換(圖6-12B)。當G變成X時，由於X優先與C配對，雖然不出現G-C→A-T轉換，但XC本身是不正常的堿基對(圖6-12C)。同時，亞硝酸也可引起交聯，並曾觀察到交聯的G-G和G-A(圖6-11)。[HT5”SS][JZ]圖6-12 亞硝酸的氧化脫氨作用及其影響[HT5SS]　　重硫酸鹽可使C脫氨變為U而引起突變(圖6-13)。[HT5”SS][JZ]圖6-13 重硝酸鹽的脫氨作用[HT5SS]　　肼為一種弱誘變劑，主要作用於胞嘧啶(pH6)，在N4上發生取代反應產生N4氨基胞嘧啶(圖6-10)。 (2) 烷化劑類：主要指烷基硫酸酯類及其N亞硝基化合物類，前者包括二烷基硫酸酯(如硫酸二甲酯，DMS；硫酸二乙酯，DES)和烷基磺酸鏈烷(如甲基磺酸甲酯，MeMS；甲基磺酸乙酯，EtMS；乙基磺酸乙酯，EtES)。後者包括二烷基亞硝胺(如二甲基亞硝胺，DMNA；二乙基亞硝胺，DENA)，N亞硝基脲(如甲基亞硝基脲，MeNU；乙基亞硝基脲，EtNU)和N烷基N硝基N亞硝胍(如甲基硝基亞硝基胍，MNNG)(圖6-14)，它們的誘變作用各不相同，作用活性順序為甲基〉乙基〉更高同聚物。多聚核苷酸上的所有氧(O)和氮(N)(除了直接與糖相接的N外)均可在pH中性水溶液中被烷基化，其中烷基硫酸酯幾乎完全與N反應，而N亞硝基化合物主要作用於O。各種堿基烷化後的衍生物如圖6-15所示。[HT5”SS][JZ]圖6-14 簡單烷化劑的結構[HT5SS][HT5”SS][JZ]圖6-15 簡單烷化劑在水溶中與核酸或多核苷酸反應的位點 [HT5SS]　　此外還有環狀烷化劑，包括氮芥、硫芥、β丙酸內酯和脂肪環氧化物等(圖6-16)。其中最早研究的是氮芥、硫芥，它們可與G的N7、A的N1、C的N3反應，氮芥也可使兩個G的N7間發生交聯。β丙酸內酯可與G的N7和A的N1反應，也可形成分子內交聯，推測A的N3也可被修飾。脂肪族環氧化物，如乙烯氧化物、丙烯氧化物，為弱的誘變劑，環氧化物類似於典型的烷化劑，與DNA和RNA上G的N7，A的N1和N3反應，形成羥乙基或羥丙基衍生物。[HT5”SS][JZ]圖6-16 環狀烷化劑類的結構[HT5SS]　　最後一種重要的烷化劑為鹽亞硝基脲(halonitrosoureas)，包括1,3雙［2氯乙基］1亞硝基脲(BCNU)，雙［2氟乙基］亞硝基脲(BFNU)和1［2氯乙基］3 環己基1亞硝基脲(CCNU)(圖6-17)，它們可在G的N7上形成鹽乙基、羥乙基和氨乙基衍生物，或在A的N1和C的N3上發生鹽乙基反應形成環乙基衍生物，此外，也在DNA中觀察到O6羥乙基鳥嘌呤和3羥乙基胞嘧啶。[HT5”SS][JZ]圖6-17 鹽亞硝基脲類的結構[HT5SS]　　經烷化的堿基除了可導致隨後的配對錯誤外，還可能因為從核苷酸序列中脫掉而留下一個缺口，影響DNA的複製，或使核苷酸序列縮短，引起移碼突變；同一DNA分子鏈內或不同DNA分子的鏈間形成交聯，也能使一個或幾個核苷酸缺失。

 

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