3.研究方法 研究病毒的遺傳變異，包括幾方麵的內容：從整體水平上研究病毒的突變率，即某病毒基因組一次複製過程中某一核苷酸位點因置換、缺失或插入而改變的可能性；根據某一遺傳學指標(見上述)，從自然流行毒株中篩選或結合應用誘變因素篩選有意義的變異株；分析變異株突變的性質；通過人工突變研究某一位點(或區域)的改變對病毒遺傳性狀的影響。下麵分別加以敘述。
(1) 病毒突變率研究：確定病毒突變率的方法有多種。首先，最直接的方法是體外測定病毒基因組複製酶的錯配率，如水皰性口炎病毒(VSV)RNA聚合酶的錯配率為10-3.15，但在體內聚合酶的錯配率可能要更低一些；其次，病毒突變率可根據由一個純化克隆衍生而來的病毒基因組群體中核苷酸置換的頻率估計出來；或者由同一蝕斑衍生而來的大量病毒克隆的直接序列分析測定出來，後兩種方法或許不能精確地反映病毒突變率，因為某些突變是致死性的，而且傳代次數不易確定。除直接測定序列外，也可通過以下方法間接獲得病毒的突變率：①從一個病毒克隆株中呈現特定表型的變異株出現的頻率估計突變率。溫度敏感性生長特性、蝕斑形態學、宿主範圍以及致病性等表型受幾種基因上不同突變的影響，顯然不適於進行突變率的研究，不過，如果突變株及其回複突變株的突變性質清楚的話，某一表現型改變的變異株的回複突變頻率可用於測定堿基置換率。Bos和Nayak(1986)測出一個流感病毒ts-變異株的突變率為10-3.5，Morita等(1987)報道了4個VSV ts-變異株的突變率分別為10-3.5、10-3.6、10-4.0和10-4.9；②測定野生型病毒克隆中抵抗病毒複製抑製劑的變異株出現的頻率以估計病毒突變率。Pincus等(1986)測得脊髓灰質炎病毒胍抵抗性變異株出現的頻率為10-7.4和10-6.7之間，該突變表型需要2個獨立的突變，說明核苷酸置換率為10-3.7～10-3.4；③測定克隆中抵抗中和性單克隆抗體的變異株出現的頻率，這是報道應用最多的方法。 不同病毒因不同方法測定的突變率各不相同。例如，用單克隆抗體測定的流感病毒RNA置換頻率約為10-6，而根據ts-變異株回複突變以及直接序列分析相關的克隆RNA確定的結果為10-4；同樣地，VSV中和作用抵抗變異株出現的頻率比VSV ts- 變異株回複突變率(10-3.5～10-4.9)或直接序列分析VSV基因組RNA核苷酸置換獲得的突變率(10-3.7)低10～100倍。相反，直接分析脊髓灰質炎病毒克隆測定的置換頻率(〈10-5)比胍抵抗性變異株出現頻率和中和作用抵抗性變異株出現頻率低10～100倍。但無論怎樣，應用同一種方法可以評價不同病毒的相對突變率。 有關DNA病毒突變率的資料較少，但似乎與RNA病毒相類似。單純皰疹病毒(HSV)的中和作用抵抗性變異株的突變率為≥10-5，犬細小病毒的中和作用抵抗性變異株的突變率為10-3.4和10-5.4之間。
(2) 人工篩選變異株：在動物病毒變異研究中最具有實際意義的是獲得毒力低，而仍保持免疫原性的弱毒株，也就是針對病毒致病性這一遺傳學指標進行研究。動物病毒的許多毒力變異株是人工培育的結果，概括起來有以下幾種減毒方法：[HT5K]異種動物適應性變異[HT5SS] 醫學及獸醫學上許多弱毒疫苗株就是利用通過自然條件下不感染或不易感染的所謂異種動物這個途徑獲得的。將強毒株轉移到新宿主(一般常用實驗動物)，開始時往往不引起或僅引起輕微的感染症狀(或病變)。但是隨著傳代次數的增加，症狀或病變逐漸增劇，甚至引起典型的發病、死亡。而此時往往減低了對其原宿主的毒力。例如豬瘟兔化弱毒株，就是多代通過兔體，在增高對兔體毒力的同時減低了其對原宿主(豬)毒力的豬瘟病毒株。同樣，兔化牛瘟毒株、鼠化和兔化口蹄疫毒株、鼠化馬瘟毒株等也都是適應於異種動物的典型例子。[HT5K]異常感染途徑適應性變異[HT5SS] 將病毒通過非正常感染途徑接種，也可達到使毒力致弱的目的。朱既明等在將森林腦炎病毒株對乳鼠進行連續的腦內接種傳代後，在腹腔或皮下注射時的毒力逐步降低，傳代40次後，皮下注射基本上不能致病。黃熱病病毒也有這樣的例子，泛嗜性黃熱病病毒經小鼠腦內連續接種傳代後變為嗜神經性，泛嗜性消失，非腦內接種時不再呈現病原性。[HT5K]雞胚適應性變異[HT5SS] 30年代發展起來的雞胚培養技術，對病毒培養和弱毒疫苗株的培育起了巨大的推動作用，至今它仍然是病毒學研究的常規技術之一。雞胚化牛瘟病毒株、雞胚化乙型腦炎毒株、雞胚化狂犬病毒株等都曾成功地用作疫苗毒株。[HT5K]細胞適應性變異 [HT5SS]40年代發展起來的組織細胞培養技術成為病毒研究中的重要方法，也是目前應用於弱毒株篩選中的主要手段。例如乙型腦炎病毒經倉鼠腎細胞、雞胚成纖維細胞傳代後，對人及家畜的毒力明顯下降；麻疹病毒經雞胚成纖維細胞傳代後對人的毒力下降等；犬肝炎病毒通過豬腎細胞培養，牛瘟病毒通過綠猴腎細胞培養，也都獲得了弱毒株。應用同種動物細胞，例如將豬瘟病毒和牛腹瀉—粘膜病病毒分別在豬白細胞培養物和牛腎細胞中傳代，也獲得了弱毒株。但因敏感細胞缺乏選擇性，病毒粒子不純。故以敏感細胞培育的弱毒株，應再以蝕斑法或終點稀釋法進一步純化。 必須指出的是，某些病毒的感染範圍很窄，即使應用上述多代“強迫”接種方法，仍難適應在異種動物或細胞中增殖，當然無法應用這一手段達到減毒目的。[HT5K]ts-變異株和低溫適應株的培育 [HT5SS]由於ts-變異株和低溫適應株的毒力一般都較原毒株低。因此，應用誘變劑選育ts-變異株以及應用低溫培養方法培育低溫適應株，已是實驗室內取得弱毒株的一個重要手段。這類變異株常可通過誘變劑處理同時進行適當選育的方法獲得。在已經接種病毒的細胞培養物中加入亞硝酸、鹽酸羥胺或5溴脫氧尿核苷和2氨基嘌呤作誘變劑，雖然絕大多數病毒此時已經滅活，但仍可能殘存少數病毒保持活力，這些病毒在上述誘變劑的作用下發生突變經過一定程度的增殖之後，即有可能從中選育出ts-突變株。例如Sambrook等(1966)應用5溴脫氧尿核苷和2氨基嘌呤作誘變劑，加入已經接種兔痘病毒的雞胚成纖維細胞的維持液中，再經蝕斑選育，獲得隻能在34.5℃(稱為允許溫度)而不能在39.5℃(稱為非允許溫度或限製溫度)增殖的突變株；Williams(1971年應用亞硝酸、羥胺和5溴脫氧尿核苷等作誘變劑，育成了40個腺病毒ts-突變株，可在31℃生長，但不能在38℃增殖；Pringle(1971)在培養液內加入5氟尿嘧啶，隨後作蝕斑分離，由881個VSV克隆株中選育出9個穩定的ts-變異株，這些ts-變異株可在31℃增殖，但不能在40℃增殖。 目前已在流感病毒、口蹄疫病毒、新城疫病毒、水皰性口炎病毒、腺病毒、呼腸孤病毒、腦炎病毒和多型瘤病毒等多種病毒中，通過類似方法獲得了ts-變異株。[HT5K]重組試驗 [HT5SS]不僅是研究病毒遺傳學，特別是了解病毒基因的排列組合及
其與表現性狀之間的關係等的一個重要手段，也是培育或創造新毒株的一個有效途徑。 實驗室內的重組試驗常在培養細胞或雞胚中進行。親本株必須盡可能純化，而且兩個親本株之間至少需要具有兩個以上的性狀差別。將兩個親本株混合感染培養細胞或雞胚以後，收獲子代病毒，並作純係分離，選育其中具備兩個親本株“雜交”性狀的新毒株，即為重組型。例如一個重組型流感病毒可以具有來源自一個親代病毒株的血凝素和另一個親代病毒株的神經氨酸酶。Tumova等(1965)應用活的甲2型流感病毒和紫外線滅活的雞瘟病毒混合感染雞胚組織培養細胞，獲得一株具有雞瘟病毒蝕斑形成能力和甲2型流感病毒不耐熱血凝素特性的重組型病毒，此株病毒同時含有上述兩種病毒的株特異性抗原。熊光明用口蹄疫病毒(FMDV)和豬腸道病毒(EV)混合感染IBRS2細胞，經過適當的篩選、克隆，鑒定了一個具有FMDV和EV抗原特性的重組病毒株。
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