理化學因子對病毒的作用-病毒消毒法

由於多數病毒在細胞外較快滅活，特別是在炎熱季節，披膜病毒、正粘病毒和副粘

病毒等在外界環境以及腐敗的動物屍體中迅速死亡，所以隻要將汙染的設備或房舍閑置幾天，即可達到自然消毒目的。痘病毒和某些皰疹病毒在外界環境中的抵抗力較強，在有蛋白質性保護層例如痂皮時，更能長期活存，這就要求應用有效的消毒劑。病毒學實踐中經常應用燒堿等作環境消毒劑，實驗室內則常應用高錳酸鉀、雙氧水和次氯酸鹽等氧化劑。福爾馬林也有較強的消毒作用，但作用較慢，且因對鼻、眼等粘膜具有較大的刺激性和不良氣味，故不被經常采用。石炭酸和煤酚類消毒劑如來蘇兒，並不屬於特別有效的病毒消毒劑，通常需用較大濃度，才能達到完全消毒的目的。由於國內供應較多，且價格便宜，來蘇兒一直在被廣泛應用，但不宜用於口蹄疫病毒。對於不耐酸的病毒，實驗室內較常應用1%鹽酸溶液浸泡玻璃和塑料製品，如吸管和微量培養板、滴定板等。環氧乙烷等氣體消毒劑由於有較強的穿透作用，可以用於無菌室、汙染的工作服、實驗器材、超淨工作台等的消毒。影響消毒劑作用效果的因素很多，如消毒劑的濃度、消毒環境的溫度、濕度、pH、病毒的種類及有無有機物存在等，因此在實際消毒中，要根據病毒的種類，選擇合適的消毒劑和濃度，控製環境條件，方能取得理想的消毒效果。在科學研究和生產實踐中，經常還要觀察和比較消毒劑的殺病毒效果，測定消毒後病毒被滅活的程度。為此，必須進行殺病毒試驗。其一般程序是將經過處理的樣品接種於雞胚、組織培養細胞或敏感的動物，培養後觀察有無殘留病毒生長，並與對照樣本相比較，求出病毒滅活的水平。至於病毒滅活到何種程度才算消毒合格，目前國內外都沒有統一標準。國外一般要求消毒後病毒滴度比消毒前降低3個log(3個數量級)。蘇格蘭農業部門規定，用口蹄疫病毒和雞新城疫病毒進行消毒試驗時，要求消毒後病毒的滴度比消毒前滴度降低4個log。我國習慣用滅活率來表示消毒效果，滅活率應達到999%～9999%。〖JZ〗滅活率=〖SX(〗消毒前病毒量-消毒後病毒量〖〗消毒前病毒量〖SX)〗測定消毒劑殺病毒作用的試驗，國內外迄今沒有統一的標準，下麵介紹幾種應用較多的方法。〖BT4〗1.布片載體消毒試驗劉育京等在觀測流感病毒(疫苗株)消毒效果時曾應用這種試驗。其方法是將脫脂布片(棉布或亞麻布)浸入適當稀釋的流感病毒液中30分鍾後，取出置37℃溫箱幹燥15分鍾，放冰箱備用。試驗時將試驗組布片按預定時間暴露於消毒劑，對照組布片不暴露於消毒劑。然後按預定時間回收病毒：方法是將每個布片放入5ml滅菌肉湯或生理鹽水(含適當濃度的可中和消毒劑的化學物質及青、鏈黴素各100U/ml或100μg/ml)，用力吹打80次，洗下樣片上的病毒。將樣片的洗液作係列10倍稀釋，然後各稀釋度分別吸取02ml，接種雞胚，每個稀釋度接種雞胚4隻；將接種的雞胚放37℃溫箱，培養48～72小時；用1%雞紅細胞懸液與雞胚囊液作血凝試驗，有陽性者說明雞胚被感染。本試驗除設置未經消毒處理的病毒樣片對照外，還應設置經消毒處理的未感染病毒樣片對照、未接種樣片洗液的雞胚對照和細胞毒性對照——用消毒劑和中和劑混合液接種雞胚。若作定性試驗，可用樣片洗液的原液接種雞胚，以消毒組樣片接種的雞胚全部陰性為消毒合格。但試驗應重複5～10次，以求得穩定的結果。若作定量分析，可求出對照樣片和消毒樣片各自的半數雞胚感染劑量(EID50)(見本書第十四章)，並計算出病毒滅活率。〖BT4〗2.載體環消毒試驗1964年，Lorenz和Fenn用這種試驗方法檢查了幾種消毒劑對雞新城疫病毒的滅活作用。具體方法是取20個載體不鏽鋼環放入20ml澄清的病毒尿囊液中，浸泡15分鍾後取出，放於瓷盤內，於37℃幹燥20～60分鍾備用。試驗時，將消毒劑作係列稀釋，每管10ml，放於20℃；每管放入載體環一隻，間隔時間為1分鍾，共10隻染有病毒的載體環被浸入消毒液內；在第一個載體環放入後10分鍾，將其取出，放入1ml營養肉湯管內(成含有適當濃度的可中和消毒劑的物質)，1分鍾後，將第二隻載體環轉移入肉湯管內，如此直至10隻載體環全部轉移入肉湯管，肉湯管也放在20℃下。最後一個載體環取出後，立即取每個肉湯洗液01ml接種10～20天的雞胚，每管肉湯接種6個雞胚，應在15分鍾內將60個雞胚接種完畢。接種後每天在照蛋燈下檢蛋，接種24小時內死亡的雞胚應從試驗中剔除。從接種後24小時到120小時的96小時內，若有雞胚發生死亡，則可判斷為該濃度不能滅活病毒。若全部雞胚都存活，則該稀釋度可被判斷為消毒有效的稀釋度。這一試驗不僅用於能引起雞胚死亡的病毒作試驗。而且能引起雞胚絨毛膜囊膜形成痘斑和能阻止雞胚發育的病毒也可進行此試驗。該方法經改進後，也可用於檢查消毒劑對適於組織培養的其它病毒的消毒效果。但Wright等用水泡性口炎病毒進行本試驗時，發現載體環傳染病毒的回收率低。Chen也發現，殺菌性試驗中用的不鏽鋼環載體不能攜帶足夠濃度的單純皰疹病毒，所以不能用於殺病毒試驗。〖BT4〗3.漂浮載體消毒試驗Groen等設計了“殺病毒劑漂浮技術”，測定甲醛和戊二醛以及次氯酸鈉等的殺病毒效力，取得較好結果。據認為還可用於其它對細胞培養物毒性很強的消毒劑的殺病毒效果試驗。方法是將2%的瓊脂糖塊切成約1cm3的小塊，置於載玻片的一端。將已知量的病毒懸液滴於瓊脂糖塊的表麵，任其擴散、蒸發，直至表麵完全幹燥，此過程約需10分鍾。隨後加二滴溶於二氯乙烷的05%(W/V)聚乙烯醇縮甲醛(BDH)，待其停留幾秒鍾，將載玻片垂直立於吸水紙上，以除去多餘的聚乙烯醇縮甲醛。幹燥後用銳利的刀片修切瓊脂糖塊的邊緣。隨後輕輕浸入消毒劑溶液中。這樣，一個含有病毒的薄膜片就釋放並“漂浮”於消毒液的表麵。記錄消毒劑與病毒接觸的時間。隨後用一根封口的毛細吸管將該薄膜片從消毒劑溶液中取出，輕輕接觸1支滅菌試管的管壁，以除去多餘的消毒劑。隨後將薄膜片轉移到1ml的組織培養液中，再用封口毛細吸管將薄膜片弄碎，使剩餘的病毒粒子釋放到液體中，並用之接種細胞培養物，滴定殘活的病毒。對照組用組織培養液代替消毒劑溶液。4.水懸浮消毒試驗該試驗不借助於其它固相載體，直接將試驗的消毒劑溶液與未經稀釋的病毒懸液01ml相混合(有些研究中將病毒稀釋至1：100)，在室溫下接種1、3、5和10分鍾後，用肉湯將病毒消毒劑混合物作10倍連續稀釋，至病毒滴度的終點。未用消毒劑作用的對照組也如此稀釋。因為消毒劑對組織培養細胞有毒性，所以測定從10－３稀釋度開始，每個稀釋度取01ml(用10－３～１０-7或10-8稀釋度)接種培養。對流感病毒，接種孵育10天的雞胚尿囊腔，培養40小時以後用血凝試驗檢查尿囊腔有無病毒存在。對單純皰疹病毒、牛痘病毒和腺病毒，用其稀釋液接種HeLa細胞，於37℃培養4～7天後，觀察細胞病變。測定試驗組的病毒滴度，並與對照組相比較，即可計算出消毒劑對各該病毒的殺滅作用及有效濃度。