化學因子
(一)化學滅活劑病毒的化學滅活劑包括酶類、蛋白變性劑、氧化劑、酸、堿以及破壞胺基的其它化學劑，如福爾馬林和亞硝酸等。1.酶類酶類的滅活作用隨病毒種類而不同。大多數病毒的衣殼蛋白或囊膜，或者兩者都能保護核酸，使其不受核酸酶的分解作用。但在某些病毒，衣殼蛋白亞單位之間的結合比較疏鬆，其裂隙足以使酶通過，例如黃瓜花葉病病毒在用低濃度的RNA酶處理後即喪失感染性。動物病毒中有無這類例子，尚待探索。但是必須指出，衣殼蛋白在其它理化學因子的作用以後發生損傷時，病毒核酸就易遭受核酸酶的分解作用。磷脂酶因破壞囊膜磷脂而使囊膜病毒滅活，可能是破壞了病毒粒子上有關吸附和侵入的結構。蛋白酶，包括胰酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和灰色鏈絲菌酶等，因能除去有囊膜病毒表麵的受體，使病毒粒子喪失吸附細胞的能力；或因破壞病毒粒子的衣殼蛋白，暴露病毒核酸，遭受核酸酶的作用而滅活。某些病毒，如小RNA病毒科的腸道病毒，對消化道內的蛋白酶具有很大的抵抗力，因此可以無損傷地通過消化道和引起感染。但痘病毒以及與腸道病毒同屬於小RNA病毒科的鼻病毒，卻對蛋白酶敏感。病毒對酶類的抵抗力，在相當程度上決定著病毒的病原性和感染方式。如上述，引起消化道感染的腸道病毒都對動物消化道內的蛋白酶具有強大抵抗力。相反，痘病毒不能抵抗胃腸中蛋白酶的作用，通常不發生消化道感染(除非在咽喉部侵入)，而主要經呼吸道或因直接接觸而感染。披膜病毒例如乙型腦炎病毒，在這方麵表現得尤為明顯：小鼠即使經口攝入大量病毒材料，如啃食腦炎死亡鼠的腦，也不發生感染，但將這種鼠腦作幾萬至幾十萬倍稀釋後給小鼠作皮下或腹腔，特別是腦內注射時，卻常可以規律地引起感染。2.pH一般來說，大多數病毒的活性在pH6～8的範圍內穩定，在pH50以下的酸性環境中以及pH90以上的堿性環境中，則迅速滅活，但是不同病毒對pH變化的穩定性差異很大。例如呼腸孤病毒能夠抵抗pH30，腸道病毒在pH22可於24小時內繼續保持其感染性，而鼻病毒等卻可被pH53迅速滅活，口蹄疫病毒對pH變化更為敏感，在pH60～65以及pH80～90均迅速滅活。披膜病毒可在較高的pH環境(80以上)中保持穩定。因此，對pH的穩定性是病毒鑒定上的一個重要指標。有趣的是，某些脊髓灰質炎病毒毒株在pH40～50的醋酸、草酸和乳酸溶液中對50℃的抵抗力明顯高於其在pH72的蒸餾水中的抵抗力。同樣，鹽酸、硝酸、磷酸和硫酸等無機酸類也可在pH30～50條件下提高脊髓灰質病毒某些弱毒株對50℃的穩定性。但是，酸性環境對大多數強毒株脊髓灰質炎病毒沒有提高穩定性的作用。根據某些病毒的耐酸特性，病毒學實驗中已經成功地應用酸性解離方法由病毒抗體複合物中分離感染性病毒。例如Mandei等將脊髓灰質炎病毒抗體複合物的pH降至20～25，Pinheiro等將柯薩奇病毒抗體複合物的pH降低至25，分別分離獲得了感染性病毒。酸、堿溶液是病毒學實踐中經常應用的消毒劑，例如汙染腦炎病毒的塑料製品(聚苯乙烯滴定板等)，就可用1%～3%鹽酸浸泡消毒。應用2%～3%NaOH溶液或生石灰堿溶液消毒口蹄疫病毒的汙染環境和用具等等。保存病毒，以中性或稍偏堿為宜。〖BT4〗3.脂溶劑包括乙醚、氯仿和丙酮、氟碳化合物、正丁醇等可以脫脂的化學物質。乙醚、氯仿和丙酮能夠滅活有囊膜病毒。但是這三種脂溶劑對囊膜脂質的溶解能力不盡相同。一般來說，乙醚具有最大的破壞作用，氯仿次之，丙酮的溶解能力最弱。應用丙酮處理披膜病毒感染的標本，雖有暴露病毒蛋白抗原的作用，但病毒往往並不完全滅活。各種痘病毒對乙醚的敏感性不同。禽痘病毒對乙醚有抵抗力，哺乳動物痘病毒則可分為對乙醚敏感和對乙醚不敏感兩類。牛痘病毒、痘苗病毒、兔痘病毒和小鼠脫腳病病毒等正痘病毒對乙醚有抵抗力，而綿羊痘病毒、山羊痘病毒及及兔粘液瘤病毒和綿羊接觸傳染性膿皰性口炎病毒等對乙醚敏感。後來發現，對乙醚敏感的痘病毒大多引起類似的細胞病理變化，抗原性上也較接近或類同。乙醚滅活試驗還是病毒鑒定中的一個重要指標。氟碳化合物(氟裏昂)和正丁烷也有抽提脂質和蛋白質的作用，故常用於病毒提純，特別是由病毒抗體複合物中解離病毒粒子或由感染材料中提取病毒抗原。正丁烷還能區分和選擇性地破壞病毒核蛋白，故在混合性病毒感染材料中可以用其消除一種病毒的感染性，而保持另一種病毒的感染性(或抗原性)。〖BT4〗4.甲醛和戊二醛甲醛及其37～40％溶液即福爾馬林，是病毒學中普遍應用的一種病毒滅活劑，在滅活疫苗的製造中尤為常用。甲醛對病毒核酸和病毒蛋白質都有破壞作用，但首先是使病毒核酸滅活——與腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶等含有胺基的堿基結合而使病毒核酸變性。甲醛較高濃度和較長時間的作用，可與病毒蛋白質的胺基結合而形成羥甲基衍生物或二羥甲基衍生物，後者再與酰胺發生交聯反應，如圖5-3所示。病毒蛋白質因而變性，阻止病毒核酸的逸出。甲醛對單鏈核酸最為有效，故常用於RNA病毒的滅活。雙鏈核酸病毒對甲醛的抵抗力較大，因此常需應用較高濃度的甲醛或者進行較長時間的作用，這樣可使病毒蛋白質受到較大損傷，從而在一定程度上降低其免疫原性。為保證甲醛有效地進入病毒粒子內部作用於核酸，有人建議將病毒材料稍稍加溫，使病毒衣殼殼粒之間形成較大的間隙，以便甲醛分子透入。在用甲醛滅活痘病毒和偽狂犬病病毒(皰疹病毒)時，就曾應用過這種方法。對於易因加溫變性的病毒，例如披膜病毒和正粘病毒，當然不宜采用這樣的滅活方法。適當濃度的甲醛滅活病毒後，病毒抗原性、血凝性均不改變，故常用其滅活病毒製造疫苗，迄今應用的滅活病毒疫苗，約有50%以上是用甲醛作滅活劑，通常應用005%～01%～02%濃度的福爾馬林。其它病毒製品如血凝抗原、補體結合抗原、瓊擴抗原也常以甲醛滅活病毒製備。戊二醛對病毒的作用與甲醛相似，但滅活作用更強，2%堿性戊二醛溶液在1分鍾內能殺滅所有病毒。在病毒學中，戊二醛常用於實驗室汙染器材如超淨工作台、離心機的擦拭消毒。用強化酸性戊二醛(含025乙烯脂肪醇醚)代替常用的3%～5%石炭酸溶液浸泡汙染的吸管、試管等，具有可靠的消毒效果。〖BT4〗5.烷化劑烷化劑如氮芥、磺酸酯、氮丙啶、乙撐亞胺、環氧乙烷、環氧丙烷、溴化甲烷、β丙內酯、乙基乙烯亞胺(EEI)、乙酰乙烯亞胺(AEI)等，帶有一個或多個活性烷基，能使蛋白質分子上遊離的羧基(COOH)、氨基(NH2)、巰基(SH)、羥基(OH)和核酸分子中的N發生烷基化作用，使病毒的蛋白質和核酸結構改變，功能喪失，從而被滅活。在病毒學中，作用劇烈的烷化劑如環氧乙烷等常用作氣體消毒劑。對多種病毒均有滅活作用，甚至對血清或雞胚尿囊液等有機物中存在的病毒亦能有效殺滅。實驗發現，1%環氧乙烷水溶液處理12～24小時，可完全殺滅血清稀釋的雞新城疫病毒、流感病毒、鼠腦脊髓炎病毒、牛痘病毒等。Sidwell用100%環氧乙烷氣體消毒，29℃6小時或60℃48分鍾，可使汙染在羊毛華達呢布片上的皰疹病毒、牛痘病毒、副流感病毒、脊髓灰質炎病毒減少到可檢出水平以下。常用10%氧化乙烯消毒不耐熱的橡膠和塑料製品。在作實驗室消毒時，可用3%～5%濃度，處理12～24小時。β丙內酯殺滅病毒的作用也很強，1g/Lβ丙內酯，在37℃作用2小時後即可殺滅血漿中的西方馬腦炎病毒、東方馬腦炎病毒、淋巴脈絡叢腦炎病毒、聖路易腦炎病毒、狂犬病病毒等。到目前為止，以流感病毒、豬瘟病毒、腺病毒、乙肝病毒、痘病毒、黃熱病毒、微小RNA病毒、皰疹病毒、東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、委內瑞拉腦炎病毒、狂犬病病毒、鼠腦炎病毒等作試驗，β丙內酯氣體均能有效地將其殺滅，一般認為，β丙內脂氣體殺滅病毒的有效濃度為5～30mg/L。低濃度的β丙內酯(2～4mg/L)以及作用緩和的烷化劑如乙基乙酰亞胺(EEI)、N乙酰乙烯亞胺(AEI)、縮水甘油醛等可以破壞病毒核酸，但不改變病毒蛋白質，因此也是滅活疫苗製造中很常用的病毒滅活劑。主要使病毒核酸的嘌呤和嘧啶基發生改變。但是各種病毒對這些化學劑的抵抗力不盡相同。同時因為這些化學劑對核酸具有較強的誘變作用，可能誘導產生突變型病毒株。因此必須保證每個病毒核酸分子都被滅活。實踐中應根據病毒材料的種類和狀態，應用正確濃度、使用方法、作用時間、溫度等等。〖BT4〗6.蛋白變性劑包括石炭酸以及陰離子去垢劑，如十二烷基硫酸鈉(SDS)和去氧膽酸鈉等以及非離子去垢劑，如吐溫20、吐溫80和NP40等。石炭酸和SDS主要用於病毒核酸提取，亦即用以剝離病毒粒子的蛋白衣殼，以便提取病毒核酸。SDS能使病毒蛋白質降解為多肽，故在分析病毒多肽種類時，經常先用SDS處理病毒粒子，隨後再用聚丙酰胺凝膠電泳技術加以分離和鑒定。SDS還有溶解病毒囊膜的作用。吐溫和去氧膽酸鈉等去垢劑具有破壞病毒囊膜的作用，但可保存病毒粒子原來的蛋白結構和抗原性，故常應用於病毒疫苗和病毒抗原的生產工藝中。去垢劑和脂溶劑結合使用，可有效地滅活有囊膜病毒。周鐵群等證實，以水泡性口炎病毒為指示病毒，加至血液製品中，在終濃度為03%的TNBP和10%的吐溫、25±1℃的條件下作用60分鍾，可將指示病毒殺滅至檢測限以下。近年來將這一原理應用於去除血液和其它生物製品中可能汙染的有囊膜病毒，已成為通用方法，即所謂的S/D法(脂溶劑/去垢劑法)。高濃度的尿素和胍因能作用於氫鍵和氨基酸殘基上非極性側鏈之間的疏水鍵，而使病毒蛋白變性。Cooper等應用32P標記的脊髓灰質炎病毒進行尿素滅活試驗，發現72mol/L的尿素最初破壞病毒對熱的抵抗力及其吸附宿主細胞的能力，但不改變病毒粒子的物理結構及其與抗體的結合能力。感作時間延長，則病毒粒子破裂，釋出病毒RNA，並殘留蛋白外殼。Dorman應用同樣濃度的尿素處理A２型流感病毒，發現尿素具有自病毒粒子中分離可溶性補體結合抗原的作用。高濃度胍的長時間處理，可使病毒蛋白最後降解為多肽。〖BT4〗7.醇類醇類中的乙醇和異丙醇是實驗室、化驗室以及床處置中常用的皮膚消毒劑，盡管它們對細菌和其它微生物有較強的殺滅作用，但對病毒的殺滅作用不強(表5-2)，曾有人從75%乙醇溶液中檢出了乙型肝炎病毒的表麵抗原，所以，醇類物質不是病毒學中可靠的消毒劑。用乙醇浸泡或用酒精棉球擦拭汙染的采血針、刀片等病毒汙染的實驗器材都不是完全有效的消毒措施。不同病毒對乙醇和異丙醇的敏感性差別比較大，相比之下，乙醇對無囊膜病毒的殺滅作用比異丙醇強，反過來，異丙醇對有囊膜病毒作用強些。
8.染料及其光動力作用某些具有扁平芳香族發色團的染料，插入核酸的相鄰堿基之間，常可導致移碼突變，或抑製RNA的轉錄，造成病毒突變或失活。染料對病毒的破壞作用，其主要對象是核酸，病毒蛋白包括囊膜中的蛋白並不發生嚴重破壞，一般仍能保持病毒粒子的免疫原性。吖啶橙插入核酸鏈後，熒光顯微鏡下單、雙鏈核酸呈現不同顏色的熒光，是病毒核酸理化特性鑒定的一個重要指標。人們很早以前還發現，某些病毒在用美藍處理後，一經暴露可見光線，就迅速滅活。後來發現其它染料，例如台盼藍、中性紅和甲苯胺藍等也有這種作用，統稱染料的光動力作用。一般認為，這些染料易於通過病毒的囊膜和衣殼，直接進入病毒粒子的內部而與核酸結合，擾亂或置換核酸分子中的嘧啶基，破壞病毒核酸的結構，使病毒粒子喪失感染性。也有人認為光動力作用是病毒核酸的鳥嘌呤殘基發生變化的結果。由於染料必須在有氧條件下才能呈現光動力作用，而還原劑又能減輕光動力作用對病毒的損傷，因此，光動力作用可能就是染料參與的一種光氧化過程。感性不同，以痘病毒、腺病毒、披膜病毒、皰疹病毒、彈狀病毒、反轉錄病毒和乳多空病毒為最敏感。染料對某些病毒的光動力作用具有實踐意義。一方麵，可以應用光動力作用滅活血液等生物製品中可能汙染的病毒，例如Lambrecht等報道，在凍幹血漿中加入高滴度人I型免疫缺陷病毒(HIV1)，再加入1μmol/L的美藍，光照5分鍾，病毒的感染滴度下降43個數量級，光照
10分鍾則下降632個數量級(檢測極限以下)。另一方麵，在蝕斑試驗中，由於營養液或覆蓋瓊脂層中含有中性紅或其它染料，為避免這些染料的光動力作用對病毒的損傷，必須將細胞培養物放於暗盒內，盡量避光，以保證病毒蝕斑的產生。
(二)保護劑有一些化學物質如甘油、蔗糖、穀氨酸鈉等等，能夠減輕病毒保存過程中其它理化學因子對病毒的損傷，從而保持病毒的感染性、抗原性等生物活性，這類物質即保護劑。1.甘油甘油是眾所周知且被廣泛應用的病毒保護劑。因在50%甘油鹽水中，大多數細菌被殺滅但病毒卻可活存達幾十天、幾個月甚至幾年(決定於病毒的種類)。病毒學實踐中常用50%甘油鹽水保存含病毒材料，同時采取冷藏措施，效果比較理想。但是必須指出，少數病毒，例如牛瘟病毒，並不能在甘油鹽水中長期活存。2.二甲基亞碸(DMSO)可減少冷凍過程中微小冰晶的形成，因而對凍存的病毒有保護作用3.病毒凍幹用保護劑常用的有明膠、血清、腖、白蛋白、穀氨酸鈉、脫脂奶、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、聚
乙烯吡咯酮等，這些物質對病毒中的最終水分含量不致過低，可防止蛋白質的變性，高分子物質如血清、明膠、白蛋白等能促進病水複原時，還能夠提高溶解性。
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