組培過程中的玻璃化問題
在進行植物組織培養時，經常會發現試管苗生長異常，表現為試管苗葉、嫩梢呈水晶透明或半透時，水浸狀；整株矮小腫脹、失綠；葉片皺縮成縱向卷曲、脆弱易碎；葉表缺少角質層蠟質，沒有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織。這種試管苗生長異常現象就是P.Debergh（1981）首先命名的“玻璃化”（Vitrification）。是植物組織培養過程中所特有的一種生理失調或生理病變。
玻璃苗中因其體內含水量高，幹物質、葉綠素、蛋白質、纖維素和森質素含量低、角質層、柵欄組織等發育不全，表現為光合能力和酶活性降低，組織畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很難繼續用作繼代培養和擴大繁殖的材；生根困難，移栽後也很難成活。植物微體快速繁殖時玻璃苗的出現已成為一種很普遍的現象，該苗有時多達50%以上，嚴重影響繁殖率的提高，已成為莖尖脫毒、工廠化育苗和材料保存等方麵的嚴重障礙，造成人、財、物的極大浪費，所以試管苗下班化現象對植物組織培養的危害是相當嚴重的，也是亟待解決的問題。
（一）玻璃苗發生的因素
瓊脂和蔗糖濃度與玻璃化成負相關，瓊脂或蔗糖濃度越高，玻璃苗的比率越低。Daniel G. W. Brown認為玻璃化可能是培養基滲透勢不當所致。碳源不僅為芽的形成提供能量，而且也起滲透調節作用，主要影響培養基的滲勢（Salisbury等）。隨瓊脂濃度及純度的增加，培養基硬度增加，從而影響其襯質勢和水分狀況。Debergh等研究表明，液體培養基的水勢影響玻璃苗的形成，Ziv等認為隻要降低培養容器中的相對濕度，就可以降低玻璃苗的比例。劉思穎等（1988）測得絲石竹玻璃苗葉片的水勢約為正常苗的1.9倍，含水量為正常苗的2.09倍—2.21倍。自由水和高濕度可能與肉質嫩梢的形成有關。Davis等研究表明，液體培養是導致玻璃化的主要原因。可以斷定，試管苗玻璃化可能是培養基內水分狀態不適應的一種生理變態。
許多學者證明培養基中BA濃度和培養溫度與玻璃化成正相關，BA濃度越高或培養溫度越高，玻璃苗比率越大。Debergh曾用14C-KT研究表明，隨瓊脂濃度的增加，KT利用率降低。同時也證明，隨BA濃度的增加，玻璃化率增加。Bornman等用14C-BA研究表明，14C-BA的積累與不定芽分化和玻璃化是同步的。玻璃化苗的一個重要特征是葉脈明顯加長，而GA3也有類似效應，也許GA3促進了細胞過度生工，從而導致玻璃化。生長素可以改變細胞壁的機械特性，使其具有更大的可塑性。
許多研究表明，非受傷的物理和化學協迫可以增加乙烯的合成。玻璃化被認為是一種非受傷協迫條件下形態上的反應。玻璃苗苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性低於正常植株。在協迫條件下乙烯的快速合成，又通過抑製氨基環丙烷羧酸（ACC）酶的形成，對乙烯起反饋調節作用。通過改善氣體交換防止玻璃化形成，可能與克服乙烯反饋抑製有關。一種與膜有關的過氧化物酶直接或間接摻入ACC合成乙烯。現已證明，IAA-氧化酶體係至少在乙烯合成的最後一步起作用。IAA含量降低將進一步通過IAA調節S-腺苷甲硫氨酸（SAM）轉化成ACC這一過程，從而降低了乙烯形成。Kevers等曾證明，對於玻璃苗，堿性過氧化酶同功酶活性增加，而酸性同功酶活性降低。但總可溶性過氧化物酶活性增加，僅限於堿性提取物。有人認為，玻璃化的形成主要是膜的效應而與核酸無關。乙烯促進了葉綠素分解及細胞的畸形發展。乙烯處理破壞了膜的結構，隨著細胞壁解離，細胞內積累有在量纖維素及泡狀物質。可見，乙烯對玻璃化的影響，與改變組織的生理生化及纖維結構有關。
Hakkart F. A. 等認為玻璃苗是培養瓶內氣體與外界交換不暢造成的。密閉的封瓶口材料是導致玻璃化的原因之一（陳國菊等1992，李雲等1996）。
培養基中高的含N量，特別是高的氨態N，也是導致玻璃化的因素。
有人發現不同部位的節段外植體與玻璃化有關，以留蘭香基部節段所形成的試管苗玻璃苗嚴重，中部莖段次之，莖尖最好（柴明良）；重瓣絲石竹中部莖段出現玻璃苗較多，基部莖段較少，莖尖沒有（郭達初）。郭東紅等（1989）認為瑞香莖尖外植體大小與玻璃化相關，莖尖外植體越小，出現玻璃苗比率越大。
（二）玻璃苗發生的機理
Kevers等的試驗表明，蘋果砧木M7等的玻璃苗是由於過氧化物酶——吲哚乙酸氧化酶係統控製的乙烯過飽和的影響，並認為細胞激動素和NH4+離子的過剩是一種最初的脅迫，受脅迫的試管苗在乙烯過剩的空氣中，抑製了乙烯的生物合成，結果降低苯丙氨酸解氨酶（PAL）和酸性過氧化物酶的活性，從而妨礙組織木質化，導致形成玻璃苗。一種誘導協迫（過多的細胞分裂素和NH4+），可以通過酚含量的快速化調節不斷增加的過氧化物酶活性。乙烯的大量形成又對其自身起反饋抑製作用，結果PAL和酸性過氧化物酶活性降低，從而抑製木質化過程的進行。糖用於氨基酸的合成，纖維素含量降低。由於缺乏纖維素和木質素，壁壓降低，從而細胞過分吸水，並導致玻璃化。
張洪勝等認為在試管苗玻璃化過程中，作為內源激素的乙烯從代謝調節上起了關鍵性啟動作用。而乙烯的產生則取決於培養環境中的脅迫條件，如水勢不當，通氣不暢（造成缺氧）及培養基用BA量過高等，均會導致乙烯產生。乙烯產生後引發了其他激素質和量上的改變及酶類的變化。因此，發生蛋白質、纖維素和木質素的合成障礙及降解，葉綠素分解黃化，逐漸形成玻璃化症狀；張昆瑜等（1991）認為乙烯克服試管苗玻璃化的機理是複雜的，在添加乙烯前體ACC（1-氨基環丙烷-1-羧酸）和乙烯釋放劑CEPA（乙烯利）的培養基上證明乙烯對香石竹試管苗幹物質積累及組織、器官的發育有利。並發現ACC可促進煙草愈傷組織中的過氧化物酶和苯丙氨酸裂解酶的活性，加強磷酸戊糖途徑與抗氰交替途徑，前兩個酶是促進木質素合成和細胞壁形成的關鍵酶，磷酸戊糖途徑與葉綠素前體的合成有關，抗氰交替途徑則降低了ATP的合成，從而抑製了過度主動吸水，提高了蛋白質和幹物質的含量。
李雲等（1996）發現植物光呼吸途徑和磷酸戊糖（HMP）途徑均與玻璃苗的產生有關，即當上述兩條呼吸途徑的一條或兩條同時受阻時，均增加玻璃苗。密封瓶口、高溫、高濃度細胞分裂素等因子加快了生長速度，加劇了瓶中氣體組成的改變，對瓶內外氣體交換提出更高要求，當這種要求不能滿足時便出現玻璃化。HMP途徑的中間步驟與戊糖化合物代謝有關（如核酸合成），也與木質素形成有關。當HMP途徑被抑製時，壁的再生受抑製，戊糖化合物減少，核酸、蛋白質合成受阻。當光呼吸途徑被抑製時，減弱了光呼吸對光合的保護作用，過剩的同化物損壞了光合細胞器，不僅降低了光合作用，同時也阻礙了乙醇酸的的轉化，加重了乙醇酸對植物的毒害作用，從而導致玻璃化的產生。
（三）防止和克服玻璃苗的措施
盡管關於玻璃化的成因及其生理機製到目前為止仍未得出一致的結論，但對某些植物的玻璃化已得到有效的控製。這些研究表明，控製玻璃化要從培養的環境條件和生理生化方麵入手，具體措施如下：
利用固體培養，增加瓊脂濃度，降低培養基的襯質勢，造成細胞吸水阻遏。提高瓊脂純度，也可降低玻璃化。
適當提高培養基中蔗糖含量或加入滲透劑，降低培養基中的滲透勢，減少培養基中植物材料可獲得的水分，造成水分脅迫。
降低培養容器內部環境的相對濕度。
適當降低培養基中細胞分裂素和赤黴素的濃度。
控製溫度適當低溫處理，避免過高的培養溫度在晝夜變溫交替的情況下比恒溫效果好。
增加自然光照。試驗發現，玻璃苗放於自然光下幾天後莖、葉變紅，玻璃化逐漸消失，因自然光中的紫外線能促進試管苗成熟，加快木質化。
增加培養基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Mn元素含量，降低N和Cl元素比例，特別降低銨態氮濃度，提高硝態氮含量。
改善培養容器的通風換氣條件，如用棉塞或通氣好的封口膜封口。
青黴素G鉀（2mg/L—6mg/L）能有效防治菊花試管苗的玻璃化（陳龍清等），青黴素（40萬單位/升）可降低芥菜試管苗的玻璃化（陳國菊等）。
培養基中加入間苯三酚或根皮苷。
用40℃熱擊（周菊華等）處理瑞香愈傷組織培養物，可完全消除再生苗的玻璃化，且能夠提高愈傷組織的芽分化頻率，熱擊處理會降低內源細胞分裂素水平。
一些添加物可有效地減輕或防治玻璃化，如王家旺等添加馬鈴薯汁或活性炭降低了油菜玻璃苗頻率；郭達初等用10mg/L—15mg/L的CCC或0.5mg/L—1.0mg/L的PP333減少了重瓣絲石竹試管苗玻璃化的發生；師校欣等（1990）添加1.5g/L-2.0g/L的聚乙烯醇防治蘋果砧木玻璃化；張昆瑜等增加容器中乙烯含量克服香石竹玻璃化的發生。
盡管如此，不同植物在不同條件下，也許會得出不同的結論或相反的結果。更有效的玻璃化控製途徑，有等於進一步研究。
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