2 結果
2.1 目的蛋白的表達 SDS2PAGE電泳可見,pBEX2PPM1A2His經IPTG誘導2、4h後在大腸杆菌中均有表達,4h時獲得量最大,空菌誘導4h僅有較弱條帶。且PPM1A的產量隨IPTG的濃度加大變化不大.
2.2 目的蛋白的純化和複性 誘導後的菌體處理後經超速離心,SDS2PAGE電泳發現大部分目的蛋白存在於沉澱中,主要以包涵體形式存在。用Ni2NTA純化試劑盒處理所得的目的蛋白純度達90%,質量濃度為2.45mg/mL,複性後目的蛋白質量濃度為1.15mg/mL。
2.3 目的蛋白的Western2blot鑒定 空菌組無明顯條帶,誘導菌組可見較強條帶,提示IPTG誘導後所得的蛋白為目的蛋白。
2.4 多克隆抗體滴度檢測 純化的PPM1A重組蛋白0.1g/mL每孔100L包被,ELISA法測得的抗體滴度達到1∶100000。
2.5 多克隆抗體的特異性檢測 PPM1A多克隆抗體1∶800作為第一抗體,用Envision免疫組化法檢測肝癌組織Edmondson病理分級Ⅰ級中PPM1A的表達,同時用PPM1A鼠單克隆抗體和正常小鼠血清分別為陽性對照和陰性對照為第一抗體檢測,結果可見PPM1A多克隆抗體組和PPM1A鼠單克隆抗體陽性對照組的肝細胞胞核和胞漿明顯陽性表達,而正常小鼠血清組則無著色;另也用免疫熒光法檢測HepG2細胞中PPM1A的表達,PPM1A多克隆抗體1∶50組細胞的胞核陽性著色,正常小鼠血清組則未見明顯熒光。
3 討論
PPM1A蛋白磷酸酶1A(以前2C)(PP2CA;MGC9201;PP2C2ALPHA是一種抑癌基因,定位於染色體14q23.1,47604bp,屬於絲/蘇蛋白磷酸酶的PP2C家族,為一常見的鎂或錳離子依賴的去磷酸化酶,定位於胞漿和核,使MAP激酶和MAPK激酶去磷酸化而起負調節作用;能使細胞周期蛋白依賴的激酶去磷酸化,參與細胞周期的調控;可抑製環境應激反應誘導的p38和JNK激酶級聯作用;其過量表達可激活抑癌基因TP53/p53的表達,導致細胞周期停滯於G/M期和引起細胞凋亡,從而可能參與腫瘤的發生機製調節。
TGF2家族成員廣泛存在於從果蠅到人類的多種生物的各種組織中,控製多種正常細胞的發育過程,參與一些癌症、自身免疫疾病和纖維化疾病的發生發展。TGF2信號通路的應答中一個關鍵的步驟就是Smad2被TGF2受體II磷酸化後與Smad3,Smad4形成複合體,移位細胞核中,與序列特異的DNA結合蛋白CRB/P300等結合,啟動TGF2通路,激活特定的靶基因。Xu等人研究認為Smad2的磷酸化與去磷酸化對TGF2信號通路的調節起重要作用,而近期發現PPM1A就是那種特異的去磷酸化酶,促進核中Smads的去磷酸而轉移出核,PPM1A的異常表達會消除TGF2誘導的抗增生核轉錄反應,但是刪除PPM1A會使哺乳動物細胞中的TGF2號途徑活性增高。資料顯示TGF2/Smads通路是肝髒細胞生長的一個重要調節因子,參與肝細胞的生長、分化、黏附、轉移、細胞外基質的形成及免疫調節等,肝癌組織中磷酸化Smad2核聚集可與肝髒腫瘤的惡性程度密切相關。故而,進一步深入研究肝組織中PPM1A的功能有深遠意義。
該試驗中,我們利用製備的PPM1A鼠多克隆抗體,采用免疫組化法檢測肝癌組織中PPM1A的表達,顯示其結果與用PPM1A單克隆抗體檢測相似,用免疫熒光法檢測了HepG2細胞中的PPM1A的表達主要定位於胞核,與文獻報道的結果一致示了PPM1A鼠多克隆抗體能特異地檢測肝組織中PPM1A的表達,為下一步深入研究肝細胞中PPM1A的功能以及與TGF信號通路的聯係對肝癌發生的影響等研究打下了基礎,為尋找新的治療策略提供了參考資料。
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