TGF2/Smads通路在肝癌的發病機製中占重要作用,核中磷酸化的Smad2P2Smad2的聚集可能對肝癌的發生發展有重要意義,Lin等人在研究乳腺癌中發現PPM1A磷酸酶可通過使核中磷酸化的Smad2的C末端SXSS去磷酸化來調節TGF2/Smads通路,從而也使大家對探索肝癌的發生機製及尋找新的有效治療靶點有了新的希望,PPM1A蛋白磷酸酶的有關研究成為焦點,但因其抗體的不足,限製了研究進展。在這裏,我們利用PPM1A蛋白磷酸酶全長原核表達質粒製備特異性的鼠多克隆抗體,為研究PPM1A在肝癌或其他疾病中的生物學特性.
1.1 主要材料 異丙基22D硫代半乳糖苷IPTGNi2NTASpinColumn試劑盒抗組氨酸His6標簽鼠單克隆抗體和HRP標記的羊抗鼠IgG工作濃度分別為1∶1000和1∶5000;PPM1A鼠單克隆抗體工作濃度為1∶100;FITC標記的羊抗鼠IgG為Picerce公司產品,工作濃度1∶100;DMEM培養基幹粉胎牛血清購自杭州四季青公司;氫氧化鋁佐劑pBEX12PPM1A2His原核表達質粒,高效表達菌BL21(DE3)plysS及HepG2細胞均由本室保存;5～7周齡雌性Balb/c小鼠,
1.2 重組質粒的原核表達 將含有pBEXPPM1A2His重組質粒的BL21DE3plysS菌接種於5mLSOB液體培養基含100mg/L氨苄青黴素和35mg/L氯黴素,37℃振蕩培養12h後,按1∶100比例接種到200mLSOB液體培養基中,37℃振蕩培養4～6hA600nm=0.4～0.6時,加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L,37℃,250r/min誘導4h,同時空載體進行同樣的轉化和誘導作為對照。
1.3 目的蛋白純化和複性 用Ni2NTA法純化蛋白,先將菌體沉澱按5mL/g的濕重混懸於預冷的裂解緩衝液中,反複凍融3次,然後超聲破菌,溶解物4℃,10000g離心20min,棄上清液,沉澱經包涵體純化步驟後,沉澱溶於6mL尿素,按Qiagen公司的Ni2NTASpinColumn試劑盒說明書進行目的蛋白的純化,並用SDS2PAGE電泳觀察純化效果。將純化所得蛋白用冷PBS透析複性。
1.4 目的蛋白的濃度及純度檢測 目的蛋白BL21DE3進行SDS2PAGE電泳後,進行蛋白條帶灰度掃描,用Gelwork1DadvancedV4.01軟件進行純度分析。並用標準的Bradford檢測法測定目的蛋白的濃度。
1.5 目的蛋白Westernblot鑒定 按Westernblot操作步驟進行。空菌及重組質粒轉化菌變性後經SDS2PAGE分離,半幹法轉印蛋白到硝酸纖維素膜上,用100mL/L的FCS/PBST4℃封閉過夜,加入第一抗體鼠抗His抗體/鼠抗PPM1A單克隆抗體,37℃震蕩孵育1h,PBST漂洗3次,加入稀釋的第二抗體HRP標記的羊抗鼠IgG,37℃震蕩孵育1h,PBST漂洗3次,加入ECL孵育,壓片曝光。
1.6 動物免疫 將Ni2NTA純化回收並複性的目的蛋白350g溶於500L生理鹽水中,再與等體積的氫氧化鋁佐劑混合,按35μgII隻的抗原劑量分別免疫9隻Balb/c小鼠,背部皮內多點注射。第14天和第28天各加強免疫1次,加強免疫的方法和抗原劑量同上。第35天摘小鼠眼球取血,靜置離心後分離血清,4℃保存。
1.7 抗體滴度檢測 參照文獻[3]的ELISA法檢測抗體效價。即用Ni2NTA法純化所得的PPM1A2His融合蛋白目的抗原按10g/mL、1g/mL和0.1g/mL的梯度,包被ELISA板100L/孔,4℃孵育過夜,用新配製的PBST洗液洗5次,50g/LBSA每孔200μL封閉後,加入用10mL/LFBS/PBS稀釋的不同梯度的免疫小鼠血清抗體按1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000),37℃孵育1h,PBST洗5次,加1∶5000稀釋的酶標二抗HRP標記的羊抗鼠IgG,37℃孵育60min,PBST洗5次,以四甲基聯苯胺TMB2過氧化氫係統為底物37℃顯色5min後,終止,酶標儀450nm波長檢測各孔吸光度值。同時以正常鼠血清為陰性對照及PBS為一抗空白。
1.8 多克隆抗體特異性檢測 ①免疫組織化學檢測:利用PPM1A多克隆抗體1∶800稀釋檢測人肝癌組織PPM1A的表達,按DAKOEnvision法試劑盒說明書操作,DAB法顯色,以正常小鼠血清和PBS分別作為陰性對照和空白對照。②免疫熒光檢測:24孔板中用含100mL/L新生牛血清的DMEM培養基常規培養的HepG2細胞貼壁生長至80%～90%融合,用PBS洗3次,用冷500mL/L甲醇固定15min,1mL/LTritonX2100室溫處理10min,100mL/L正常羊血清室溫封閉20min,加入PPM1A多克隆抗體血清1∶50,對照組加入同樣稀釋的未經免疫的小鼠血清,4℃孵育過夜,PBS洗3次,加入FITC標記的山羊抗小鼠二抗1∶100,37℃,避光孵育30min,PBS洗3次後用熒光顯微鏡觀察並記錄。
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