PTEN是迄今為止發現的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因,它通過發揮磷酸酶作用,降低多種信號傳導途徑的關鍵酶的磷酸化水平,阻斷信號傳導通路,以抑製細胞的生長、黏附、鋪展和遷移,誘導凋亡,從而對腫瘤的生長、侵襲和轉移產生負性調節作用。PI3K2Akt途徑是蛋白激酶偶聯受體介導的一條重要的信號轉導通路,細胞外信號分子通過磷酸化依次激活三磷酸酰肌醇激酶PI3K、蛋白激酶BAkt/PKB及其他下遊信號分子,以促進細胞的增殖,抑製凋亡並對細胞周期起正調控作用,導致細胞惡性轉化。本實驗檢測PTEN基因轉染前後膀胱癌細胞P110(PI3K的催化亞單位、磷酸化P110、Akt和磷酸化Akt的表達情況,以期證明PTEN可能通過PI3K2Akt信號傳導途徑起抑癌作用。
1、材料與方法
1.1主要材料和試劑 人膀胱癌細胞,pBp2PTEN及pBabe2puro(pBp)空質粒,DH5α大腸杆菌菌株。Trizol和大量質粒抽提純化試劑盒、限製性內切酶EcoRⅠ、脂質體Lipofectamine2000、PCR引物、通用RT2PCR試劑盒
1.2細菌的轉化和擴增培養 氯化鈣法製備感受態大腸杆菌DH5。於EP管中加入質粒和感受態DH5混勻後至水浴中熱休克,再加入無抗生素LB培養基孵育。從EP管中取菌液,接種於含氨苄青黴素的LB瓊脂平板上,培養過夜。挑取單個菌落,轉入含氨苄青黴素的LB培養基中,振搖過夜至飽和生長,-70℃冰箱保存。
1.3質粒的抽提純化和酶切鑒定 取質粒轉化的菌液到含氨苄青黴素的LB培養基中,振搖過夜。按大量質粒抽提純化試劑盒說明書的步驟,提取並純化pBp2PTEN或pBp。將純化的質粒DNA,於紫外分光光度計上檢測純度,A260/A280=1.8—2符合要求。瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切DNA片段。
1.4基因轉染和細胞篩選 在6孔板中接種BIU287細胞,培養至滿70%-80%,按脂質體Lipo2fectamine2000說明書的步驟,將pBp2PTEN或空質粒pBp導入BIU287細胞,轉染24h後換液,並於熒光顯微鏡下觀察,繼續培養48h,加嘌呤黴素篩選並擴增培養。
1.5RT2PCR提取細胞RNA後,按通用RT2PCR試劑盒步驟進行操作。反應條件:94℃預變性5min,94℃變性50s,58℃退火50s,72℃延伸1min,循環32周,72℃再延伸8min。將pBp2PTEN轉染細胞pBp2PTEN2BIU87、pBp轉染細胞pBp2BIU87和未轉染細胞(BIU287)的PCR產物分別經2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙啶染色,凝膠分析係統觀察。
1.6Westernblot製作凝膠SDS2聚丙烯酰胺凝膠後,凝膠板安置於電泳槽,將處理好的樣品加入槽內。電泳後取出凝膠,進行半幹式電轉移,膠中的蛋白質將轉移至膜上。最後行免疫顯色。膜置濾紙上幹燥,分析結果。質粒鑒定證實含有PTEN基因,RT2PCR證實PTEN轉染後穩定表達。三種細胞P110和Akt的Westernblot陽性條帶強度相似,提示轉染前後P110和Akt蛋白的總水平無明顯變化;PTEN轉染後,磷酸化P110和磷酸化Akt的陽性條帶明顯較對照組弱,說明PTEN轉染導致P110和Akt的磷酸化水平降低
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