6、操作步驟
6.1肉毒毒素檢測
液狀檢樣可直接離心，固體或半流動檢樣須加適量（例如等量、倍量或5倍量、10倍量）明膠磷酸鹽緩衝液，浸泡、研碎，然後離心，取上清液進行檢測．另取一部分上清液，調pH6.2，每9份加10％胰酶（活力1：25的水溶液37℃作用60min，進行檢測。肉毒毒素檢測以小白鼠腹腔注射法為標準方法6.1.1檢出試驗：取上述離心上清液及其胰酶激活處理液分別注射小白鼠三隻，每隻0.5mL觀察4d 注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射後24h發病、死亡。主要症狀為豎毛、四膠癱軟，呼吸困難，呼吸呈風箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最終死於呼吸麻痹。
遇小鼠拌死以至症狀不明顯時，則可將注射液做適當稀釋，重做試驗。
6.1.2 證試驗：不論上清液或其胰酶激活處理液，凡能致小鼠發病、死亡者，取樣分成三份進行試驗，一份加等量多型混合肉毒抗毒診斷血清，混勻，37℃作用30min，一份加等量明膠磷酸鹽緩衝液，混勻，煮沸10min，一份加等量明膠磷酸盆緩衝液，混勻即可，不做其他處理。三份混合液分別注射小白鼠各兩隻，每隻0.5ml觀察4d，若注射加診斷血清與煮沸加熱的兩份餛合液的小白鼠均獲保護存活，而唯有注射米經其他處理的混合液的小白鼠以特有的症狀死亡．則可判定檢樣中的肉毒毒素存在，必耍時要進行毒力測定及定型試驗，6.1.3 力測定：取已判定含有肉毒毒素的檢樣離心上清液，用明膠磷酸鹽緩衝液做成50、500 及500倍的稀釋液，分別注射小白鼠各兩隻，每隻0.5L觀察4d 根據動物死亡情況，計算檢樣所含肉毒毒素的大體毒力（MLD/ml或MLD/g）例如：5、5倍及500稀釋致動物全部死亡，而注射5 00稀釋液的動物全部存活，則可大體判定檢樣上清液所含毒素的毒力為1000MLD/mL——10000MLD/mL
6.1.4 型試驗：按毒力測定結果，用明膠磷酸鹽緩衝液將檢樣上清液稀釋至所含毒索的毒力大體在10MLD/mL——1000MLD/mL範圍，分別與各單型肉毒抗診斷血清等量混勻，37℃作用30min，各注射小鼠兩隻，每隻0.5mL，觀察4d。同時以明膠磷酸鹽緩衝液代替診斷血清，與稀釋毒素液等量餛合作為對照。能保護動物免於發病、死亡的診斷血清型即為檢樣所含肉毒毒素的型別。注1朱經胰酶激活處理的檢樣的毒素檢出試驗或確證試驗若為陽性結果，則胰酶激活處理液可省略毒力測定及定型試驗。
注2：為爭取時間盡決得出結果毒素檢測的各項試驗也可同時進行。
注3：根據具體條件和可能性，定型試驗可酌情先省略C、D、F及G型，
注4，進行確證及定型等中和試驗時，檢樣的稀釋應參照所用肉毒診斷血清的效價。
注5：試驗動物的觀察可按陽性結果的出現隨時結束，以縮短觀察時間；唯有出現陰性結果時，應保留充分的觀察時間。
6.2肉毒梭菌檢出（增菌產毒培養試驗）取厄肉培養基三支，煮沸10min——15min，做如下處理：a）第一支：急速冷卻，接種檢樣均質液1mL——2mL;b）第二支：冷卻至60℃，接種檢樣，繼續於60℃保溫10min，急速冷卻；c）第三支：接種檢樣，繼續煮沸加熱10min，急速冷卻。以上接種物於30℃培養5d，若無生長，可再培養10d。培養到期，若有生長，取培養液離心，以其上清液進行毒素檢測試驗，方法同6.1，陽性結果證明檢樣中有肉毒梭菌存在。
6.3分離培養選取經毒素檢測試驗證實含有肉毒梭菌的前述增菌產毒培養物（必要時可重複一次適宜的加熱處理）接種卵黃瓊脂平板，35℃厭氧培養48h。肉毒梭菌在卵黃瓊脂平板上生長時，菌落及周圍培養基表麵覆蓋著特有的虹彩樣（或珍珠您樣）薄層，但G型菌無此現象。根據菌落形態及菌體形態挑取可疑菌落，接種應肉培養基，於30℃培養5d，進行毒素檢測及培養特性檢查確證試驗。
6.3.1毒素檢測：試驗方法同6.1。
6.3.2培養特性檢查：接種卵黃瓊脂平板，分成兩份，分別在35℃的需氧和厭氧條件下培養48h，觀察生長情況及菌落形態。肉毒梭菌隻有在厭氧條件下才能在卵黃瓊脂平板上生長並形成具有上述特征的菌落，而在需氧條件下則不生長。注：為檢出蜂蜜中存在的肉毒梭菌，蜂蜜檢樣需預溫37℃（流質蜂蜜），或52℃～53℃（晶質蜂蜜）充分攪並後立即稱取20g溶於100mL滅菌燕餾水（37℃或52℃～53℃），攪拌稀釋，以8000r/min一10000r／min，離心30min(20℃），沉澱，加滅菌蒸餾水1mL，充分搖勻．等分各半，接種應肉培養基8ml——10ml各一支，分別在30℃及37℃下厭氧培養7d，按6.2進行肉毒毒素檢測。
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