一、基本原理
革蘭氏染色反應是細菌分類和鑒定的重要性狀。它是1884年由丹麥醫師Gram創立的。革蘭氏染色法（Gram stain）不僅能觀察到細菌的形態而且還可將所有細菌區分為兩大類：染色反應呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G+表示；染色反應呈紅色（複染顏色）的稱為革蘭氏陰性細菌，用G-表示。細菌對於革蘭氏染色的不同反應，是由於它們細胞壁的成分和結構不同而造成的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要是由肽聚糖形成的網狀結構組成的，在染色過程中，當用乙醇處理時，由於脫水而引起網狀結構中的孔徑變小，通透性降低，使結晶紫-碘複合物被保留在細胞內而不易脫色，因此，呈現藍紫色；革蘭氏陰性細菌的細胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質含量高，當用乙醇處理時，脂類物質溶解，細胞壁的通透性增加，使結晶紫-碘複合物易被乙醇抽出而脫色，然後又被染上了複染液（番紅）的顏色，因此呈現紅色。
革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料（basic dye）初染液；媒染劑（mordant）；脫色劑（decolorising agent）和複染液（counterstain）。堿性染料初染液的作用象在細菌的單染色法基本原理中所述的那樣，而用於革蘭氏染色的初染液一般是結晶紫（crystal violet）。媒染劑的作用是增加染料和細胞之間的親和性或附著力，即以某種方式幫助染料固定在細胞上，使不易脫落，碘（iodine）是常用的媒染劑。脫色劑是將被染色的細胞進行脫色，不同類型的細胞脫色反應不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95％的酒精（ethanol）。複染液也是一種堿性染料，其顏色不同於初染液，複染的目的是使被脫色的細胞染上不同於初染液的顏色，而未被脫色的細胞仍然保持初染的顏色，從而將細胞區分成G+和G-兩大類群，常用的複染液是番紅。
二、器材
大腸杆菌，枯草芽孢杆菌；
革蘭氏染色液，載玻片，顯微鏡等。
三、操作步驟
1．塗片將培養14—16小時的枯草芽孢杆菌和培養24小時的大腸杆菌分別作塗片（注意塗片切不可過於濃厚），幹燥、固定。固定時通過火焰1—2次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。
2．染色
（1）初染 加草酸銨結晶紫一滴，約一分鍾，水洗。
（2）媒染 滴加碘液衝去殘水，並覆蓋約一分鍾，水洗。
（3）脫色 將載玻片上麵的水甩淨，並襯以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現紫色時為止，約20—30秒鍾，立即用水衝淨酒精。
（4）複染 用番紅液染1—2分鍾，水洗。
（5）鏡檢 幹燥後，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的細菌的革蘭氏染色反應為準，過於密集的細菌，常常呈假陽性。
（6）同法在一載玻片上以大腸杆菌與枯草芽孢杆菌混合製片，作革蘭氏染色對比。
革蘭氏染色的關鍵在於嚴格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結果，如陽性菌培養時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應。
四、實驗報告
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