一、基本原理
1．電子顯微鏡的分辨力和放大率
電子顯微鏡是利用電子流代替光學顯微鏡的光束使物體放大成像而由此得名的。發射電子流的電子源部分稱為電子槍，電子槍由發射電子的“V”形鎢絲及陽極板組成，在高真空中，鎢絲被加熱到白熾程度，其尖端便發射出電子，發射出來的電子受到陽極很高的正電壓的吸引，使電子得到很大的加速度而到達樣品。電壓越高，電子流速度越快，波長越短，其分辨能力也越強。一般用50—100kV電壓時，電子波長在0．54—0．37nm，所以電子顯微鏡的分辨力極高，可達0．2nm左右，此分辨力比光學顯微鏡提高了近1000倍。
在電子流的通路上不能有遊離的氣體分子存在，否則由於氣體分子與電子的碰撞而造成電子的偏轉，導致物像散亂不清。因此，電子顯微鏡除需要高電壓外，還需要高真空的裝置。
電子顯微鏡的放大率是由透鏡決定的，在電子顯微鏡中，透鏡是由看不見的電磁場構成的，稱為電磁透鏡，簡稱磁透鏡。由電子槍發射出的電子流可以通過磁透鏡的磁場吸引發生偏折而放大物體，這與光學顯微鏡的光線通過玻璃透鏡發生折射而放大物體的情況一樣，但它不同於光學顯微鏡的是可利用多個磁透鏡的組合而得到逐級放大的電子像，所以現代電子顯微鏡的成像係統由多個電磁透鏡組成。而光學顯微鏡由於玻璃透鏡本身存在有相差的缺陷，其放大率不能通過增加透鏡的數目來無止境地提高。
此外，通過改變這些電磁透鏡的磁場強度也可提高放大率。磁場越強，焦距越短，放大倍數也就越大。所以現代電子顯微鏡的成像物鏡大多數采用短焦距的強磁透鏡，放大倍數可達一百萬倍以上。
圖Ⅲ-12表示電子顯微鏡鏡體剖麵圖。從圖上可以看到構成電子顯微鏡的主要部件及其位置。
2．電子顯微鏡的成像原理
任何一個物體都是由原子組成的，原子則是由原子核與軌道電子組成的。當電子束照射到樣品上的時候，一部分電子能從原子與原子之間的空隙中穿透過去，其餘的電子有一部分會與原子核或原子的軌道電子發生碰撞被散射開來；一部分電子從樣品表麵被反射出來；還有一些電子是被樣品吸收以後，樣品激化而又從樣品本身反射出來等。如果把所有這些不同類型的電子收集起來，使它們成像，便可以構成不同類型的電子顯微鏡（圖Ⅲ—13）。這裏隻著重介紹透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡。
（1）透射電子顯微鏡
從圖Ⅲ-13可以看出透射電子顯微鏡收集的是透過樣品的電子。在透射電子顯微鏡中，物像的形成主要來自電子的散射作用與幹涉作用。散射作用分“彈性散射”和“非彈性散射”兩種。彈性散射指電子和原子核發生碰撞，電子基本上不損失能量，而隻是改變運動方向，這種碰撞稱為彈性碰撞，這時候我們說電子發生了“彈性散射”作用。如果電子是和軌道電子發生碰撞，電子不僅會改變原來運動的方向，而且還會損失一部分能量，這時電子便發生了“非彈性散射”作用。
由於物體上不同部位的結構不同，它們散射電子的能力也各不相同，結果使透過樣品的電子束發生疏密的差別，在散射電子能力強的地方，透過去的電子數目少，因而打在熒光屏上所發出的光就弱，顯現為暗區；而散射電子能力弱的地方，透過的電子數目多，打在熒光屏上所發出的光就強，顯現為亮區，這樣，便在終像上造成了有亮有暗的區域，因而出現了反差，人眼就可以辨別。散射作用形成的反差造成強度上的變化，因此又稱為“振幅反差”。由於在電子顯微鏡中利用的是人眼看不見的電子流，所以通常用一塊熒光屏來把電子流轉換成可見的熒光，使人眼可以接受。
除了散射作用能引起反差外，電子的幹涉作用也能造成反差，在電子發生非彈性碰撞的時候，由於電子會失去一部分能量，因而使它前進的速度變慢，這部分速度減慢的電子會和速度不變的電子發生幹涉作用，結果造成電子相位上的變化，從而也引起反差，稱為“相位反差”。
在低倍觀察時，振幅反差是主要的反差來源，而在高倍觀察時，也就是在辨別極小的（如1nm大小）細微結構時，相位反差則起主要作用。
（2）掃描電子顯微鏡
與透射電子顯微鏡不同，掃描電子顯微鏡是把從樣品表麵反射出來的電子收集起來並使它們成像，所以又稱反射電子顯微鏡。掃描電子顯微鏡的成像原理與電視或電傳真照片的原理相似，由電子槍產生的電子束經過三個磁透鏡的作用，形成一個很細的電子束，稱為電子探針。電子探針經過透鏡聚焦到樣品表麵上，按著順序逐行逐行地通過樣品，也就是對樣品掃描，然後把從樣品表麵發射出來的各種電子（二次電子、反射電子等）用探測器收集起來，並轉變為電流信號經放大後再送到顯像管轉變成圖像。
掃描電子顯微鏡主要用來觀察樣品的表麵結構，分辨力可達10nm，放大範圍很廣，可從20倍到幾十萬倍。透射電子顯微鏡的分辨力雖然很高，但是一般隻能觀察切成薄片後的二維圖像，掃描電子顯微鏡能夠直接觀察樣品表麵的立體結構，並且具有明顯的真實感。許多電子無法透過的較厚樣品，隻能用掃描電子顯微鏡才能看到。
光學顯微鏡、透射電子顯微鏡以及掃描電子顯微鏡的比較見圖Ⅲ-14。
二、器材
銅網若幹個，瓷漏鬥，無菌鑷子，無菌滴管，大頭針，載玻片，細菌計數板，普通光學顯微鏡；
醋酸戊脂，濃硫酸，無水乙醇，無菌水，2％磷鎢酸鈉（pH6．5—8．0）水溶液；
大腸杆菌（大腸埃希氏菌，Escherichia coli）斜麵。
三、樣品製備
根據電子顯微鏡類型的不同，相應地也就有各種不同的樣品製備技術，本實驗主要介紹透射電子顯微鏡的樣品製備技術。
由於電子顯微鏡的整個操作都需要在高真空中進行，所以被觀察的微生物標本必須是幹燥的，否則就會引起菌體細胞發生收縮變形。同時又因為電子流的穿透能力很弱，不能透過載玻片或較厚的標本，所以需要將標本放在由金屬網作支架的火棉膠或聚乙烯甲醛薄膜上觀察，此膜又稱載膜或支持膜（掃描電子顯微鏡可用蓋玻片）。
1．製作支持膜
支持膜的厚度一般在15nm左右，太薄會影響它的機械支持力，太厚
又會影響成像的分辨力。支持膜可用塑料膜（如火棉膠膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金屬膜（如鈹膜等）。在常規工作條件下，用塑料膜就可以達到要求。常用的金屬網有銅網和不鏽鋼網。本實驗以銅網火棉膠膜為例說明支持膜的製作方法。
（1）銅網的處理 銅網為圓形，直徑一般是2．3或3．0mm，其規格有150、200、250目之分，其中比較常用的是200目（200個孔）。銅網在製膜前要清洗、脫水，否則會影響膜的質量和標本照片的清晰度。處理方法是先用醋酸戊酯浸漂若幹小時後，用蒸餾水衝洗數次，然後再將銅網浸漂在無水酒精中進行脫水，最後將洗淨的銅網放入瓷漏鬥或小培養皿內，漏鬥下麵套上乳膠管，用止水夾控製水流。然後緩緩向漏鬥內放入無菌水，其量為1cm左右，用無菌鑷子尖輕輕排除網上的氣泡，並將其均勻地擺在瓷漏鬥的中心區域。
若銅網經以上處理仍不幹淨時，可用稀釋的濃硫酸（1：1）處理1分鍾左右，立即用無菌蒸餾水衝洗數次，然後放入無水酒精中脫水。
（2）配製火棉膠 將1．5g火棉膠溶於100ml醋酸戊酯中。
（3）製膜 用無菌滴管取上述火棉膠液滴在瓷漏鬥的水麵上，待醋酸戊酯蒸發，火棉膠則由於水的表麵張力隨即在水麵上形成一層薄膜（勿振動），用鑷子將它除掉，如此操作兩次以清除水麵上的雜質。然後再適量滴一滴火棉膠液以形成支持膜（火棉膠液滴的多少與膜的厚薄關係很大，要適量控製）。鬆開止水夾，緩緩放掉漏鬥中的水，使膜自然下沉，並緊貼在銅網上，在此過程中切勿使膜皺折。最後在瓷漏鬥上覆蓋一潔淨的紙，讓膜自然幹燥。
將幹燥後的膜用大頭針的針尖在銅網周圍劃破，再用無菌鑷子小心地將銅網膜移到載玻片上，置普通光學顯微鏡下用低倍鏡檢查，挑選無皺折、完整無缺、厚薄均勻的銅網膜備用。
2．製片
有許多種製片方法，如直接貼印法、滴液法、負染色法和超薄切片法等。本實驗介紹負染色法，此法常用來觀察病毒粒子、高分子和細菌等。所謂負染色法是將樣品用電子密度高，本身不顯示結構且與樣品幾乎不反應的物質（如磷鎢酸鈉或磷鎢酸鉀）來包圍樣品，即不是被樣品成分所吸附而是沉積到樣品四周。如果樣品具有表麵結構，這種物質還能穿透進表麵上凹陷的部分，這樣，在有染液的重金屬元素沉積的地方，散射電子的能力強，因而樣品四周表現為暗區；在有樣品的地方散射電子的能力弱，因而表現為亮區。這樣便能把樣品的外形與表麵結構清楚地襯托出來。具體操作如下：
（1）將適量無菌水加入生長良好的大腸杆菌斜麵內，用吸管輕輕撥動菌體製成菌懸液。用無菌濾紙過濾，並調整濾液中的細胞濃度為每毫升108—109個。
（2）取等量的上述菌懸液與等量的2％的磷鎢酸鈉水溶液（pH6．5—8．0）混合，製成混合菌懸液。
（3）用無菌毛細吸管吸取混合菌懸液滴在銅網膜上。
（4）經3—5分鍾後，用濾紙吸去餘水，待樣品幹燥後，先置低倍光學顯微鏡下檢查，挑選膜完整、菌體分布均勻的銅網置電子顯微鏡觀察。
為了保持形狀，常用戊二醛、甲醛、餓酸蒸汽等試劑小心固定後再進行染色。其方法是將無菌水製備好的菌懸液經過濾，然後向濾液中加幾滴固定液（如0．15％的戊二醛磷酸緩衝液，pH7．2），經這樣預先稍加固定後，離心，收集菌體，製成菌懸液，再加幾滴新鮮的戊二醛，在室溫或4℃冰箱內固定一夜，次日離心，收集菌體，再用無菌水製成菌懸液，並調整細胞濃度為每毫升108—109個，然後按上述方法染色。
四、實驗報告
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