一、基本原理
暗視野顯微鏡可以看到活細胞的外部形態，但是看不清內部結構。相差顯微鏡不僅能觀察活細胞的形態，而且還能看到細胞內部結構以及細胞分裂的連續過程。
光線通過透明物體如活細菌細胞後，由於受透明物體中密度和折射率不同的物質的影響，部分光線變成了繞射光，光波的相位發生變化，而這種相位差不表現為明暗和顏色上的差異，不能在顯微鏡視野中觀察到。相差顯微鏡就是將經過透明物體的直射光延遲或提前，並和繞射光產生幹涉，使相位差變為振幅差。如果產生的幹涉為相長幹涉（圖Ⅲ-8，R組光線），則振幅的同相量相加而變大，我們便看到較亮的部分；如果所產生的幹涉為相消幹涉時（如圖Ⅲ-8，S組光線），則振幅異相量相消而變小，這部分就變得較暗。這樣，變相位差為振幅差的結果，使原來透明的物體表現出明顯的明暗差異，對比度增加，能更清晰地觀察活細胞的細微結構。
相差顯微鏡成像原理和裝置如圖Ⅲ-9所示。
在普通光學顯微鏡上增加下列四種附件就成為相差顯微鏡：
（1）環狀光闌
相差顯微鏡的聚光鏡光闌是環狀光闌。照明光線隻能從環狀的透明區進入聚光鏡再斜射到標本上（斜射角度遠小於暗視野聚光鏡）。大小不同的環狀光闌成一轉盤（圖Ⅲ-10，A），安裝於聚光鏡下麵，更換放大率不同的物鏡時，要同時更換與其相應的光闌。
（2）相差物鏡（鏡頭上標有PC或PH字樣）
物鏡的後焦平麵上裝有相板，這是相差顯微鏡的主要裝置。相板上和環狀光闌相對應的環狀部分大多數是塗的吸收膜和推遲相位膜，其他部分完全透明。從標本上射過來的光線，繞射光部分穿過透明區；直射光則穿過相板的環狀部分，光強度減弱，相位也適當改變。一般所用的相板推遲相位1/4，吸收80％的直射光，這樣，就使直射光和繞射光的強度接近，而相位差則增大或減少。由於透明標本內部構造的折射率不同，產生繞射光的相位就會有不同程度的推遲，繞射光和直射光的幹涉作用將相位差變成振幅差。
（3）綠色濾光片
為了獲得良好的相差，最好用單色光線照明，一般選用綠色光線。
（4）合軸調整望遠鏡
為使環狀光闌的中心與物鏡的光軸完全在一直線上，必須拔出目鏡，裝上特別的低倍望遠鏡（圖Ⅲ-10，B），使相板的暗環與環狀光闌的明環合軸（圖Ⅲ-11）。
二、器材
相差顯微鏡，1．0mm以下載玻片，0．16-0．17mm以下蓋玻片；釀酒酵母水浸片，枯草芽孢杆菌水浸片。
三、操作步驟
1．將釀酒酵母水浸片置載物台上，夾好。
2．轉動聚光器下麵的環狀光闌轉盤至“0”，並將光圈開到最大。
3．通過普通目鏡和低倍相差物鏡（如10×）調節焦距，看清標本。
4．轉動轉換器，使油鏡相差物鏡（90×）對準標本，同時轉動環狀光闌轉盤至40，使與所用的物鏡相符。
5．用細調節器調節焦距，使物像清楚。
6．取下目鏡，換上合軸調節望遠鏡，轉動望遠鏡使聚光鏡中的亮環和物鏡中的暗環看清楚。
7．轉動聚光鏡左右二側的調節杆，使兩環重合。
8．取下望遠鏡換上目鏡進行觀察，每更換標本或改變不同倍數的相差物鏡時，都必須依上法重新合軸調節。
9．換上枯草芽孢杆菌的水浸片進行觀察（必須先進行合軸調節）。
四、實驗報告
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