5 大腸菌群的測定
5.1 大腸菌群MPN值的測定
5.1.1 對每個樣品,選擇適宜的三個連續稀釋度的樣品稀釋液。每個稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白(月示)(LST)肉湯,每管接種1mL。
5.1.2 將接種管置於36±1℃培養48±2h。
5.1.3 觀察試管的產氣情況：檢查倒管內是否有氣泡產生,記錄在24h和48h內產氣的LST肉湯管數。如所有LST肉湯管均未產氣,則可報告為大腸菌群陰性；如有產氣者,則進一步作證實試驗。
5.2 大腸菌群的證實試驗
5.2.1 將所有產氣管用直徑為3mm的接種環移種到煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯管中。
5.2.2 置BGLB肉湯管於36±1℃培養48±2h。
5.2.3 記錄所有BGLB肉湯管的產氣管數。
5.2.4 結果報告：按BGLB肉湯產氣管數,查MPN表[見附錄B (補充件)]報告每克(毫升)樣品中大腸菌群的MPN值。
6 糞大腸菌群測定
6.1 用直徑為3mm的接種環將所有48±2h內產氣的LST肉湯管培養物移種於EC肉湯管中。 6.2 將所有接種的EC肉湯管在30min內放入帶蓋44.5±0.5℃水浴箱內,培養24±2h。水浴箱的水平麵應高於肉湯培養基液麵。應以已知為44.5℃產氣陽性的大腸杆菌和44.5℃不產氣的產氣腸杆菌或其他大腸菌群細菌作陽性和陰性對照。
6.3 記錄EC肉湯管的產氣情況。產氣管為糞大腸菌群試驗陽性；不產氣管為糞大腸菌群試驗陰性。
6.4 結果報告：按產氣管數,查MPN表報告每克(毫升)樣品中糞大腸菌群的MPN值。
7 大腸杆菌測定
7.1 將6.3條中的EC肉湯管繼續培養24h,取其產氣管的培養物劃線接種於伊紅美藍(EMB)平板,36±1℃培養24±2h。
7.2 檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。
7.3 如有典型菌落,則從每個平板上至少挑取2個典型菌落；如無典型菌落,則從每個平板上至少挑取2個可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位,移種到營養瓊脂斜麵上,36±1℃培養18～24h。
7.4 將斜麵培養物移種到下列培養基中進行生化試驗。
7.4.1 色氨酸肉湯：在36±1℃培養24±2h後,加Kovacs氏試劑0.2～0.3mL,上層出現紅色為靛基質陽性反應。
7.4.2 MR-VP培養基：在36±1℃培養48±2h。以無菌操作移取培養物1 mL至13mm×100mm試管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結晶,振搖試管後靜置2h,如出現伊紅色,為VP試驗陽性。將MR-VP培養物的剩餘部分再培養48h滴加5 滴甲基紅溶液。如培養物變紅色,為甲基紅試驗陽性,若變黃色則為陰性反應。
7.4.3 Koser氏枸椽酸鹽肉湯：於36±1℃培養96h記錄有無生長 。
7.4.4 LST肉湯：於36±1℃培養48±2h,觀察試管中是否產氣。
7.4.5 革蘭氏染色：取18h營養瓊脂斜麵培養物作革蘭氏染色。大腸杆菌為革蘭氏陰性。 7.4.6 大腸杆菌與非大腸杆菌生化鑒別如下：
靛 基 質 MR VP 枸椽酸鹽 鑒定(型別)
＋ ＋ － － 典型大腸杆菌
－ ＋ － － 非典型大腸杆菌
＋ ＋ － ＋ 典型中間型
－ ＋ － ＋ 非典型中間型
－ － ＋ ＋ 典型產氣腸杆菌
＋ － ＋ ＋ 非典型產氣腸杆菌
如出現上表以外的生化反應類型,表明培養物可能不純,應重新劃線分離,必要時做 重複試驗。
7.5 結果報告：大腸杆菌為革蘭氏陰性無芽孢杆菌,發酵乳糖產酸產氣,IMViC試驗為＋＋ －－或－＋－－,再根據LST肉湯陽性管數查MPN表,報告每克(毫升)樣品中大腸杆菌MPN 值。
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