5 增菌培養和分離
5.1 對新鮮樣品,可選擇3個連續適宜的稀釋度,分別以1mL無菌吸管各吸取1mL稀釋液, 接種10mL單料氯化鈉多粘菌素B肉湯中,進行選擇性增菌培養,每一稀釋度接種3 管(若選擇的稀釋度為接種1g樣品時,則應以10mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液10 mL,接種10 mL雙料氯化鈉多粘菌素B肉湯中)。對經加熱、輻射處理或冷藏、凍結的樣品,可按以上操作先將樣品接種於60 g/L氯化鈉蛋白腖水於37℃前增菌18～24h,然後將培養物以接種環轉種到氯化鈉多粘菌素B肉湯中進行選擇性增菌。
5.2 37℃培養18～24 h。
5.3 氯化鈉多粘菌素B肉湯管如有菌生長,則以3 mm直徑接種環分別取一環菌液,劃線於硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、膽鹽、蔗糖瓊脂(TCBS)平板上。
5.4 37℃培養18～24 h。
5.5 副溶血性弧菌在蔗糖瓊脂(TCBS)平板上的典型菌落呈圓形,邊緣整齊、濕潤、稍混濁、半透明,多數具尖心、鬥笠狀,藍綠色菌落,直徑2～4mm。
6 生化鑒定
6.1 在蔗糖瓊脂(TCBS)平板上如出現典型或可疑菌落,每個平板至少挑取兩個菌落,每個菌落分別順次接種到下列培養基進行鑒別試驗。
6.1.1 無鹽胰腖水。
6.1.2 30g/L氯化鈉胰腖水。
6.1.3 氯化鈉三糖鐵瓊脂:先穿刺後劃線。
6.2 37℃培養18～24 h。
6.3 選取在氯化鈉三糖鐵斜麵上產堿,在底層產酸,不產氣,不產硫化氫；在無鹽胰腖水中幾乎不生長,在30 g/L氯化鈉胰腖水中生長旺盛的菌株進行革蘭氏染色、鏡檢,副溶血性弧菌為革蘭氏陰性,呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態,兩端濃染、無芽胞。如符合, 繼續進行以下生化鑒定。
6.3.1 嗜鹽性試驗:各取一環30g/L氯化鈉胰腖水培養物,分別接種到70g/L及100g/L氯化鈉胰腖水中,37℃培養18～24 h。
6.3.2 細胞色素氧化酶試驗:取一環30g/L氯化鈉胰腖水培養物劃線到胰腖大豆瓊脂斜麵上,37℃培養18～24 h。
6.3.3 靛基質試驗:在6.1.2的30 g/L氯化鈉胰腖水培養物中加靛基質試劑後觀察反應。
6.3.4 賴氨酸脫羧酶試驗:由氯化鈉三糖鐵斜麵以接種針取少許培養物接種到賴氨酸試驗用培養基中,37℃培養18～24 h。
6.3.5 精氨酸雙水解酶試驗:按上項同樣操作,將培養物接種到精氨酸試驗用培養基中, 37℃培養18～24h。
6.3.6 V-P試驗:以接種針由氯化鈉三糖鐵斜麵取少許培養物穿刺V-P半固體瓊脂,37℃培養18～24h。在加V-P試劑前應先觀察動力。沿穿刺線周圍呈擴散性生長為動力陽性。
6.4 副溶血性弧菌生化特性的判定及進一步試驗如下。
6.4.1 如所分離的菌株符合表1特性,按第7章報告結果。
表1 副溶血性弧菌的生化特性
鑒定程序 生 化 項 目 反應
初 篩 氯化鈉三糖鐵
斜麵 產堿
底層 產酸,不產氣
硫化氫 陰性
嗜鹽性
無鹽胰腖水 幾乎不生長
30 g/L氯化鈉胰腖水 生長旺盛
生化鑒別 70 g/L氯化鈉胰腖水 明顯生長
100 g/L氯化鈉胰腖水 幾乎不生長
靛基質 陽性
V-P 陰性
動力 陽性
細胞色素氧化酶 陽性
賴氨酸脫羧酶 陽性
精氨酸雙水解酶 陰性
擴大生化鑒別 42℃生長 陽性
蔗糖 不分解
O/F試驗 發酵型
6.4.2如表1生化項目(擴大生化試驗項目除外)中,僅有一項生化試驗不符合時,按以下步驟做進一步鑒定
6.4.2.1 蔗糖分解試驗,42℃生長試驗,O/F試驗。如仍符合副溶血性弧菌特性,可按第 7章報告結果,如其中有一項不符合,即可排除。
6.4.2.2 副溶血性弧菌與有關細菌的鑒別可參考表2進行。
表2 副溶血性弧菌與有關細菌鑒別表
試驗 副溶血性 溶藻膠 鰻弧菌 創傷 河弧菌 麥氏弧菌 嗜水氣單胞菌 類誌賀鄰單胞菌
TCBS - - + - - - +
(藍綠色菌落)+
42℃生長 + + - v v - -
鹽耐受性試驗(生長)
0％氯化鈉 - - - - - - + +
60g/L氯化鈉+ + + + + + - -
80g/L氯化鈉+ + v - + v - -
100g/L氯化鈉- + - - - - - -
賴氨酸脫羧酶+ + - + - v - +
精氨酸雙水解酶- - v - + + v +
鳥氨酸脫羧酶+ v - v - - - v
蔗糖發酵 - + + - + + v -
乳糖發酵 - - - + - v v v
甘露醇發酵+ + + v + + + -
阿拉伯糖發酵+ - - - + - v -
V-P試驗- + v - - + v -
注:空白處表示未試驗；ｖ表示可變的。
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