1 主題內容與適用範圍
本標準規定了出口食品嗜熱菌芽孢(需氧芽孢總數、平酸芽孢和厭氧芽孢)的計數方法。 本標準適用於穀物產品和食品配料嗜熱菌芽孢計數。
其他食品可參照使用。
2 設備和材料
2.1 取樣工具：刮勺、取樣鏟等。
2.2 帶蓋樣品瓶或容器。
2.3 高壓蒸汽滅菌鍋。
2.4 天平: 感量0.01g。
2.5 均質器和1000mL帶蓋均質杯。
2.6 移液管：容量1mL、10mL(大口徑)。
2.7 培養皿：內徑90mm。
2.8 250mL三角燒瓶：具100mL刻度線。
2.9 水浴箱：溫度45～48℃。
2.10 酒精燈。
2.11 菌落計數器。
2.12 培養箱：溫度55±2℃。
2.13 蒸汽櫃。
3 培養基
3.1 葡萄糖胰蛋白腖瓊脂。
3.2 覆蓋瓊脂。
3.3 改良亞硫酸鹽瓊脂。
3.4 肝湯。
4 樣品製備
4.1 穀物：將50g樣品放入滅菌均質杯內,加入200mL滅菌蒸餾水, 以8000～10000r/min均質3min,使成均勻的混懸液。
4.2 澱粉或麵粉：將20g樣品放入盛有適量玻璃珠的250 mL滅菌三角燒瓶內,加滅菌蒸餾水至100mL刻度線,振搖,使成均勻的混懸液。
4.3 糖：將20 g幹態糖或相同糖含量的液態糖(根據白利度確定。如29.41g、68白利度的液態糖相當於20g幹態糖)放入250mL滅菌三角燒瓶內,加滅菌蒸餾水至100mL刻度線,攪拌使溶解,迅速加熱至沸並維持5min,立即用水冷卻。
5 接種培養和計數
5.1 需氧嗜熱芽孢總數
5.1.1 穀物、澱粉或麵粉:用大口徑移液管移取20 mL穀物混懸液或10 mL澱粉或麵粉混懸液,在攪拌狀態下加入盛有100mL融化的葡萄糖胰蛋白腖瓊脂(55～60℃)的250mL三角燒瓶內。將此混合物在沸水或蒸汽櫃中放置15 min。輕微攪拌使盡快冷卻,再將全部混合物等量傾注至5個滅菌培養皿內。凝固後於其表麵覆蓋一薄層2％滅菌瓊脂 (防止蔓延型菌落出現),待覆蓋瓊脂凝固後,倒置培養皿於55℃保持一定濕度培養48 h。
5.1.2 糖：於5個滅菌培養皿內各放入2 mL經熱處理的糖溶液,傾入葡萄糖胰蛋白腖瓊脂(55～60℃),輕輕搖動,使樣液與培養基混合均勻。待凝固後,倒置培養皿於55℃保持一定濕度培養48h。
5.1.3 計數5個平板上的菌落。5個平板上的菌落數相加,再乘以2即為10 g穀物中的需氧嗜熱芽孢總數。如樣品為澱粉或麵粉或糖,則5個平板上的菌落數相加,再乘以5即為10g樣品中的需氧嗜熱芽孢總數。
5.2 平酸芽孢
5.2.1 對上述5.1.1和5.1.2條中的平板再進行檢查。計數平板上直徑1～5mm,中心有不透明暗色斑點的圓形菌落。在紫色平板上,平酸菌菌落通常被黃色暈圈圍繞著。當接種菌過多(整個平板呈淡黃色)或產低酸的菌株存在時,黃色暈圈不明顯或消失。表麵以下的菌落致密,兩麵凸出,近乎針尖狀。如對表麵以下菌落有懷疑,可挑取此菌落劃線培養於葡萄糖胰蛋白腖瓊脂平板上,以證實表麵菌落的特征。
5.2.2 樣品中平酸芽孢的計算同上述5.1.3條。
5.3 產硫化氫厭氧芽孢
5.3.1 將20 mL樣品混懸液分裝於6 支剛剛排氣的改良亞硫酸鹽瓊脂試管內。如樣品為穀物、澱粉或麵粉,應旋緊試管帽,在加熱(在沸水或蒸汽櫃中放置15 min)之前和加熱過程 中輕輕顛倒試管數次,加熱後迅速用水冷卻試管。預熱試管至55℃, 並在此溫度下培養48h。5.3.2 產硫化氫厭氧菌在改良亞硫酸鹽培養基中形成烏黑發亮的特殊球形區域,開明顯氣體產生。某些不產硫化氫厭氧菌產生大量氫氣和還原亞硫酸鹽,引起瓊脂斷裂和使整個培養基變黑。但是,這種情況易與上述的黑色球形區域分開。計數6 支試管中的黑色球形區域。6支試管中的黑色球形區域數相加,再乘以2即為10g穀物中的產硫化氫厭氧芽孢數。如樣品為澱粉或麵粉或糖,則6支試管中的黑色球形區域數相加,再乘以2.5即為10g樣品中的產硫化氫厭氧芽孢數。
5.4 不產硫化氫厭氧芽孢
5.4.1 將20 mL樣品混懸液分裝於 6支剛剛排氣的肝湯試管內。如樣品為穀物、澱粉或麵粉,應立即旋緊試管帽,在加熱(在沸水或蒸汽櫃中放置15 min)之前和加熱過程中搓轉試管數次。加熱後迅速用水冷卻,並於各試管內注入50℃滅菌覆蓋瓊脂,厚度5～6cm。待瓊 脂凝固後,預熱試管至55℃,並在此溫度下培養48～72 h。
5.4.2 瓊脂斷裂,產酸,偶爾伴有幹酪氣味,被判定為不產硫化氫厭氧菌。此方法適用於定性試驗或作粗略定量估計,不能以單位樣品中芽孢數表示結果。
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