6、操作步驟
6.1增菌樣品采集後應盡快檢驗。除了易腐食品在檢驗之前預冷藏外，一般不冷藏。以無菌操作取檢祥25g(mL)，加在225mL營養肉湯中，以均質器打碎1min或用乳缽加滅菌砂磨碎。取出適量，接種乳糖膽鹽培養基，以測定大腸菌群MPN，其餘的移入500 mL廣口瓶內，於36℃ 士1℃ 培養6h。挑取1環，接種於1管30mL腸道菌增菌肉湯內，於42℃培養18h。6.2分離將乳糖發酵陽性的乳糖膽鹽發酵管和增菌液分別劃線接種麥康凱或伊紅美藍瓊脂平板；汙染嚴重的檢樣，可將檢樣勻液直接劃線接種麥康凱或伊紅美藍平板，於36℃ 士l℃培養18h——24卜，觀察菌落。不但要注意乳糖發酵的菌落，同時也要注意乳糖不發酵和遲緩發醉的菌落。6.3生化試驗6.3.1自鑒別平板上直接挑取數個菌落分別接種三糖鐵瓊脂（TSI）或克氏雙糖鐵瓊脂（KI）。同時將這些培養物分別接種蛋白陳水、半固體、pH7.2尿素瓊脂、KCN肉湯和賴氨酸脫梭酶試驗培養基。以上培養物均在36℃ 培養過夜。6.3.2 TSI斜麵產酸或不產酸，底層產酸，H2S陰性，KCN陰性和尿素陰性的培養物為大腸埃希氏菌。TSI底層不產酸，或HZS、KC綺、尿素有任一項為陽性的培養物，均非大腸埃希氏菌。必要時做氧化酶試驗和革蘭氏染色。6.4血清學試驗6.4.1假定試驗：挑取經生化試驗證實為大腸埃希氏菌瓊脂培養物，用致病性大腸埃希氏菌、侵襲性大腸埃希氏菌和產腸毒索大腸埃希氏菌多價O血清和出血性大腸埃希氏菌0157血清做玻片凝爽試驗。當與某一種多價O血清凝集時，再與該多價血清所包含的單價O血清做試驗。致瀉大腸埃希氏菌所包括的O抗原群見表1。如與某一個單價O血清呈現強凝集反應，即為假定試驗陽性。表1致瀉大腸埃希氏菌所包括的O抗原群
大腸埃希氏菌的種類 所包括的O抗原群
EPEC O26 O55 O86 OO111ab O114 O119 O125ac O127 O128ab
O142 O158
EHEC O157
EIEC O28ac O29 O112ac O115 O124 O135 O136 O143 O144 O152
O164 O167
ETEC O6 O11 O15 O20 O25 O27 O63 O78 O85 O114 O115 O126
O128ac O148 OO149 O159 O166 O167
6.4.2證實試驗：製備O抗原懸液，稀釋至與Mac Farland3號比濁管相當的濃度。原效價為(1：160)——(1：320）的O血清，用0.5％鹽水稀釋至1：40。稀釋血清與抗原懸液在10mm*75mm試管內等量混合，做單管凝集試驗。混勻後放於50℃ 水浴鍋內，經16h後觀察結果。如出現凝集，可證實為該O抗原。6.5腸毒素試驗6.5.1酶聯免疫吸附試驗檢測LT和ST 6.5.1.1產毒培養：將試驗菌株和陽性及陰性對照菌株分別接種於0.6mlCAYE培養基內，37℃振蕩培養過夜。加人20000IU/mL的多粘菌素B 0.05mL，於37℃lh，離心4000r/min 15min，分離上清液，加人0.1％硫柳汞0.1%腸mL，於4℃保存待用。6.5.1.2 LT檢測方法（雙抗體夾心法）:a）包被：先在產腸毒素大腸埃希氏菌LT和ST酶標診斷試劑盒中取出包被用LT抗體管．加入包被液0.5mL，混勻後全部吸出於3.6ml包被液中混勻，以每孔100ul量加人到40孔聚苯乙烯硬反應板中，第一孔留空作對照，於4℃ 冰箱濕盒中過夜．b）洗板：將板中溶液甩去，用洗滌液1洗三次，甩盡液體，翻轉反應板，在吸水紙上拍打，去盡孔中殘留液體。c）封閉：每孔加100拜L封閉液，於37℃水浴中lh。d）洗板：用洗滌液II洗三次，操作同上．e）加樣本：每孔分別加各種試驗菌株產毒培養液100ul, 37℃水裕中1h.f）洗板：用洗滌液II洗三次，操作同上。g）加酶標抗體：先在酶標LT抗體管中加0.5mL稀釋液，混勻後全部吸出於3.6ml稀釋液中混勻，每孔加100ul, 37℃水浴中lh。h）洗板：用洗滌液II洗三次，操作同上。i）酶底物反應：每孔（包括第一孔）各加基質液100ul，室溫下避光作用5min——10min，加人終止液50uL。j）結果判定。以酶標儀在波長492nm下測定吸光度OD值，待測標本創，值大於陰性對照3倍以上為陽性，目測顏色為桔黃色或明顯高於陰性對照為陽性。6.5.1.3 ST檢測方法（抗原競爭法）:a）包被：先在包披用ST抗原管中加0.5mL包被液，混勻後全部吸出於1.6mL包被液中混勻，以每孔加50ul加人於40孔聚苯乙烯軟反應板中。加液後輕輕敲板，使液體布滿孔底。第一孔留空作對照，置4℃冰箱濕盒中過夜。b）洗板：用洗滌液I洗三次，操作同上．c）封閉：每孔加100ul封閉液，37℃ 水浴lh。d）洗板：用洗滌液II洗三次，操作同上。e）加樣本及ST單克隆抗體：每孔分別加各試驗菌株產毒培養液50ul，稀釋的ST單克隆抗體50ul（先在ST單克隆抗體管中加0.5二L稀釋液，混勻後全部吸出於1.6 mL稀釋液中，混勻備用）, 37℃ 水浴lh。f）洗板：用洗滌液II洗三次，操作同上。g）加酶標記兔抗鼠Ig複合物：先在酶標記兔抗鼠Ig複合物管中加0.5mL稀釋液混勻後全部吸出於3.6mL稀釋液中混勻，每孔加100ul, 37℃水浴lh。h）洗板：用洗滌液II洗三次，操作同上．i）診酶底物反應：每孔（包括第一孔）各加基質液100ul，室溫下避光5min——10min，再加人終止液50ul。j）結果判定：以酶標儀在波長492nm下測定吸光度（OD）值，計算見式（1):
吸光度=（陰性對照OD值-待測樣本OD值）*100%/陰性對照OD值
吸光度二吸光度大於等於50％為陽性，目測無色或明顯淡於陰性對照為陽性。
6.5.2雙向瓊脂擴散試驗檢測LT 將被檢菌株按五點環形接種於Elek氏培養基上。以同樣操作，共做兩份，於36℃培養48h。在每株菌的菌苔上放多粘菌素B紙片，於36℃ 經5h～6h，使腸毒素滲人瓊脂中，在五點環形菌苔各5mm處的中央，挖一個直徑4mm的圓孔，並用一滴瓊脂墊底。在平板的中央孔內滴加LT抗毒素30ul，用已知產LT和不產毒菌株作對照，於36℃經15h一20h觀察結果。在菌斑和抗毒素孔之間出現白色沉澱帶者為陽性，無沉澱帶者為陰性。6.5.3乳鼠灌胃試驗檢測ST 將被檢菌株接種於Honda氏產毒肉湯內，子36℃ 培養24h，以3000r／min離心30min，取上清液經薄膜濾器過濾，加熱60℃30min，每1mL濾液內加人2％伊文思藍溶液0.02mL。將此濾液用塑料小管注人1日一4日齡的乳鼠胃內0.1mL，同時接種3隻～4隻，禁食3h～4h後用三氯甲烷麻醉，取出全部腸管，稱量腸管（包括積液）重量及剩餘體重。腸管重量與剩餘體重之比大於0.09為陽性，0.07——0.09為可疑。6.6結果報告綜合以上生化試驗、血清學試驗、腸毒素試驗作出報告。
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