主題內容與適用範圍
本標準規定了蠟樣芽胞杆菌的檢驗方法。
本標準適用於食品和食物中毒樣品中蠟樣芽胞杆菌的檢驗。
2 引用標準
GB 4789.2 食品衛生微生物學檢驗 菌落總數測定
GB 4789.28 食品衛生微生物學檢驗 染色法、培養基和試劑
3 設備和材料
3.1 溫箱:36±1℃。
3.2 普能冰箱。
3.3 顯微鏡。
3.4 恒溫水浴46±1℃。
3.5 天平。
3.6 電爐。
3.7 吸管:1 mL,10 mL。
3.8 載玻片。
3.9 均質器或乳缽。
3.10 L 型塗布棒。
3.11 滅菌刀,剪,鑷子。
3.12 三角瓶:容量 500 mL。
4 培養基和試劑
4.1 肉浸液肉湯培養基:GB 4789.28 中4.1。
4.2 酪蛋白瓊脂培養基:GB 4789.28 中4.65。
4.3 動力-硝酸鹽培養基:GB 4789.28 中4.72。
4.4 緩衝葡萄糖蛋白腖水:GB 4789.28 中3.4。
4.5 血瓊脂培養基:GB 4789.28 中4.6。
4.6 3%過氧化氫溶液。
4.7 甲萘胺-乙酸溶液。
4.8 對氨基苯碘酸-乙酸溶液。
4.9 革蘭氏染色液:GB 4789.28 中2.2。
4.10 甘露醇卵黃多粘菌素(MYP)瓊脂培養基:GB 4789.28 中4.64。
4.11 0.5%堿性複紅染色液:GB 4789.28 中2.8。
4.12 木糖-明膠培養基:GB 4789.28 中4.66。
5 操作步驟
6 操作步驟
6.1 菌數測定
以無菌操作將檢樣 25 g(mL)(按 GB 4789.2 測定),用滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩衝液做成 10(-1) ~10(-5) 的稀釋液。取各稀釋液 0.1 mL,接種在兩個選擇性培
養基——甘露醇卵黃多粘菌素(MYP)瓊脂培養基上,用L 形棒塗布於整個表麵,置 36±1℃溫箱培養基 12~20 h 後選取適當菌落數的平板進行計數,蠟樣芽胞杆菌在此培養基上的菌落為粉紅色(表示不發酵甘露醇)周圍有粉紅色的暈(表示產生卵磷脂酶)。計算後,從中挑取 5 個此種菌落做證實試驗。根據證實為蠟樣芽胞杆菌的菌落數計算出該平板上的菌落數,然後乘其稀釋倍數,即得每克(或毫升)樣品中含蠟樣芽胞杆菌數,例如 MYP 平板的可疑菌落數為25個,取5個鑒定,證實為4個,乘上稀釋倍數(如10),再乘上 1 g(或 mL)檢樣數(取的是0.1 mL 樣)則為:
25×4/5×10(4) ×10=2×10(6)
6.2 分離培養
取檢樣或稀釋液劃線分離培養於選擇性培養基(MYP)上,置37℃培養12~20 h,挑取可疑的蠟樣芽胞杆菌菌落(見6.1)接種於肉湯和營養瓊脂做成純培養,然後做證實試驗。
6.3 證實試驗
6.3.1 形態觀察
本菌為革蘭氏陽性大杆菌,寬度在 1μm或1μm以上,芽胞呈卵圓形,不突出菌體,多位於菌體中央或稍偏於一端。
6.3.2 培養特性
本菌在肉湯中生長混濁,常微有菌膜或壁環,振搖易乳化;在普通瓊脂平板上生成的菌落不透明、表麵粗糙、似毛玻璃狀或融蠟狀,邊緣不齊。
6.3.3 生化性狀及生化分型
6.3.3.1 生化性狀
本菌有動力;能產生卵磷脂酶和酪蛋白酶;過氧化氫酶試驗陽性;溶血;不發酵甘露醇和木糖;常能液化明膠和使硝酸鹽還原;在厭氧條件下能發酵葡萄糖。
6.3.3.2 生化分型
蠟樣芽胞杆菌可根據對檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、澱粉水解、V-P反應、明膠液化性狀的試驗,將該菌分成不同的型別。
表 1 蠟樣芽胞杆菌生化分型
生化試驗
型別
檸檬酸鹽利用 硝酸鹽還原 澱粉水解 V-P 反應 明膠液化
1 + + + + +
2 - + + + +
3 + + - + +
4 - - + + +
5 - - - + +
6 + - + + +
7 + - - + +
8 - + - + +
9 - + - - +
10 - + + - +
11 + + + - +
12 + + - - +
13 - - + - -
14 + - - - +
15 + - + - +
表 2 蠟樣芽胞杆菌與其他類似菌的鑒別
項目 巨大芽胞杆菌 蠟樣牙胞杆菌 蘇雲金芽胞菌 蕈狀芽胞杆菌 炭疽芽胞杆
過氧化氫酶 + + + + +
動力 ± ± ± - -
硝酸鹽還原 - + + + +
酪蛋白分解 ± + ± ± ±
卵黃反應 - + + + +
葡萄糖利用厭氧 - + + + +
甘露醇 + - - - -
木糖 ± - - - -
溶血 - + + ± ±
已知致病菌特性 產生腸毒素 對昆蟲致病的內毒素結晶 假根樣生長 對動物和人致病
注:+90%~100%的菌株陽性;-90%~100%的菌株陰性;±大多數菌株陽性;-(+)大多數菌株陰性。
本菌在生化性狀上與蘇雲菌芽胞杆菌極為相似,但後者可籍細胞內產生蛋白質毒素結晶加以鑒別。其檢查方法如下:取營養瓊脂上純培養物少許,加少量蒸餾水塗於玻片上,待自然幹燥後用弱火焰固定,加甲醇於玻片上,半分鍾後傾去甲醇,置火焰上幹燥,然後滴加 0.5%堿性複紅液,並用酒精燈加熱至微見蒸氣維持 1.5 min,移去酒精燈,將玻片放置半分鍾,傾去染液,置潔淨自來水充分漂洗,晾幹,鏡檢,在油浸鏡下檢查有無遊離芽胞和深染的似菱形的紅色結晶小體(如未形成遊離芽胞,培養物應放室溫再保存 1~2 d後再檢查),如有即為蘇雲金芽胞杆菌,蠟樣芽胞杆菌檢查為陰性。
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