玻片法凝集實驗為定性實驗,方法簡便快速,但有時會出現非特異性的凝集。試管法凝集實驗則是鑒定細菌更為準確可靠的定量實驗。常用於腦膜炎球菌、霍亂弧菌、布魯菌、沙門菌的鑒定,試管法凝集實驗也可用於血清學診斷。下麵以肥達實驗為例對實驗步驟進行說明。
肥達實驗是根據凝集反應的原理,用已知的傷寒沙門菌鞭毛抗原及菌體抗原、甲型副傷寒沙門菌鞭毛抗原、肖氏沙門菌鞭毛抗原與患者血清作定量凝集實驗,以協助診斷腸熱症。
【材料】
1、傷寒沙門菌鞭毛抗原(H)、傷寒沙門菌菌體抗原(O)、甲型副傷寒沙門菌鞭毛抗原(A)、肖氏沙門菌鞭毛抗原(B)。
2、可疑患者血清、0.9%氯化鈉等。
【操作】
1、於試管架上放4排小試管,每排8支。
2、稀釋待檢患者血清取一中試管,加0.9%氯化鈉3.8ml和患者血清0.2ml,充分混勻,此時血清稀釋度為1:20,吸此血清2ml分別加入每排的第1管中,每管0.5ml。此時中試管內剩餘稀釋血清2ml,再加入0.9%氯化鈉溶液2ml,使之稀釋成1:40。再加入每排的第2管中,每管0.5ml。以此類推,將中試管內剩餘血清依次作倍比稀釋,並依次將稀釋血清加至每排第3至第7管中,則每排各管的血清稀釋度依次為1:20,1;40,1:80,1:160,1:320,1:640,1:1280。每排第8管不加血清,隻加0.5ml0.9%氯化鈉作為對照。
3、加入菌液:由第8管開始 向前加入診斷菌液:
第一排各管加入傷寒沙門菌鞭毛抗原(H)菌液0.5ml。
第二排各管加入傷寒沙門菌菌體抗原(O)菌液0.5ml。
第三排各管加入 甲型副傷寒沙門菌鞭毛抗原(A)菌液0.5ml。
第四排各管加入 肖氏沙門菌鞭毛抗原(B)菌液0.5ml。
此時各管的血清稀釋度又各增加1倍,依次為1;40,1:80,1:160,1:320,1:640,1:1280,1:2560。每管總量1.0ml。
4、振蕩混勻,置3℃溫箱中溫育18—24h小時,取出觀察並記錄結果。
【結果】觀察結果時,先不要搖動試管,觀察試管內上清液和管底細菌凝集的特點,然後輕搖試管使凝集物從管底升起,按液體的濁度、凝集塊的大小記錄凝集程度。另外觀察結果時,要先看陰性對照管,陰性對照管不凝集時,方可觀察實驗管,否則可能係菌液自凝引起,需更換診斷菌液重新檢測。
凝集程度以“+”多少表示。
+ + + +:上層液澄清透明,細菌全部凝集沉於管底。
+ + +:上層液基本透明,大部分細菌(75%)凝集沉於管底。
+ +:上層液半透明,管底有明顯(50%)凝集物。
+:上層液混濁,管底僅有少量凝集物。
一:不凝集,液體呈乳狀與對照管相同。
效價定義:能使定量抗原呈“+ +”凝集的血清最高稀釋度為該血清的凝集效價。
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