4、具抑菌性樣品的驗證方法：對這類供試品，首先要通過抑細菌、抑真菌試驗以驗證、確定其是否具有抑菌作用，然後才選擇適合的檢驗方法。對有抑菌作用的樣品驗證消除其抑菌性的方法。通常采用中和產品抑菌性的方法，一般有3種，可將這些方法的2個或3個組合在一起使用。這3種方法是：
（1）化學鈍化中和法（又稱化學試劑中和法） 常用的鈍化劑有對氨基苯甲酸、卵磷脂、聚山梨酯80等。表列出了用於消除藥品抑菌性的常見化學中和劑，及其對某些微生物的潛在毒性。盡管化學中和劑對某些微生物有毒性，但因其中和速度快，且使用方便，所以被廣泛應用。在防腐劑抑菌效力試驗中采用化學鈍化試劑中和法，無菌檢查法中的膜過濾法和直接接種法也可考慮使用化學鈍化中和劑。有些對化學中和劑不敏感的抑菌性藥品，可采用酶法中和（如青黴素酶）。
表 中和化學抑菌劑的常用中和劑
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中和劑
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化學抑菌劑的類別
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中和劑的潛在抑菌性
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硫酸氫鹽
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戊二醛
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非芽孢細菌
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稀釋劑
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酚類、乙醇、乙醛、山梨酸酯
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—
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甘氨酸
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乙醛
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生長細胞
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卵磷脂
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季銨鹽類化合物、對羥基苯 甲酸酯類
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細菌
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Mg或Ca離子
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EDTA
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—
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聚山梨酯
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季銨鹽類化合物、碘、對羥基苯 甲酸酯類
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—
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硫基醋酸鹽
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汞製劑
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葡萄球菌類和芽孢
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硫代硫酸鹽
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汞製劑、鹵化物、乙醛
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葡萄球菌類
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（2）稀釋中和法：將樣品稀釋至最低抑菌濃度以下進行檢查。
由於化學抑菌劑的抑菌效果與其濃度呈正相關，即濃度越高，抑菌作用越強。常用稀釋法來中和檢品的抑菌性。不同抑菌劑的濃度與其抑菌效力間的相關性不同，但對某一特定的抑菌劑來說，這種相關性是恒定不變的，二者呈指數關係，可用下式表示：
Gηt=k
式中，G表示抑菌劑的濃度；t表示殺滅標準試驗菌株所需要的時間；k是一個常數；濃度指數η，是lgt與lgC作圖所得直線的斜率。抑菌劑的η值越高，其抑菌作用越易通過稀釋而被中和掉；抑菌劑的η值越低，則越難通過稀釋法來中和消除其抑菌力。
（3）薄膜過濾中和法：薄膜過濾中和法使用最廣泛，在藥品微生物學檢測中，尤其是無菌檢查中常用薄膜過濾來消除藥品的抑菌性。該法的原理是：當抑菌性產品通過濾膜過濾時，微生物被截留於濾膜上，然後，培養濾膜看其是否有微生物生長。殘留於濾膜上的抑菌成分會抑製微生物生長，應盡可能采用對檢品具有低吸附性的濾膜（如聚偏二氟乙烯 ），將抑菌效果降到最低。此外，對含防腐劑的產品，可通過稀釋或淋洗濾膜來削弱抑菌力，所用稀釋液或淋洗液應比較溫和，如0.1%蛋白腖溶液與pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液，適用於水溶性產品，含 0.1%聚山梨酯（吐溫-80）的0.1%蛋白腖溶液，適用於含卵磷脂或油類藥品。淋洗液 中所用 的化學鈍化（中和 ）劑應確保濾膜上的抑菌性殘留物不會對微生物生長產生不良影響。
5、青黴素類或頭孢類產品無菌檢查用培養基的處理：如采用直接接種法對此兩類藥物進行無菌檢查，可按以下方法調整硫乙醇酸鹽肉湯培養基及大豆胰蛋白腖液體培養基的配方，無菌操作向已滅菌的培養菌容器內加入一定量的β-內酰胺酶，使檢品中的抗生素失活。（事先測出β-內酰胺酶對青黴素或頭孢素的中和效力，再確定其用量，加有β-內酰胺酶的培養基也可用於薄膜過濾法）。β-內酰胺酶的加入量需通過驗證。
在與細菌試驗環境完全隔離的區域內進行，確定β-內酰胺酶的用量，將數量不超過100個菌（CUF）的球菌接入培養基內。若能觀察到接入菌種的典型生長現象，則證明β-內酰胺酶的加入量是合適的。
6、培養條件：微生物的生長條件也是準確測定微生物含量的重要前提條件。首先要選擇能使特定樣品中微生物能生長的適宜培養基（可通過細菌生長試驗證實），其次是確定培養的溫度和時間。可根據不同的檢查項目選用各類培養基，通常營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基，以及大豆胰蛋白腖瓊脂、肉湯等基礎培養基，因其生長菌譜廣，適宜大多數細菌生長，而常被用於一般 的細菌檢測和培養。同樣，硫乙醇鹽酸瓊脂或肉湯常被用於需氣、厭氣菌的檢測和培養，薩布羅葡萄糖瓊脂（SDA）或玫瑰紅鈉瓊脂培養基適宜黴菌生長而常被用於真菌（酵母菌、黴菌）的檢測和培養。如果樣品本身就有抑菌作用，可向上述培養基中添加適量的中和劑（如聚山梨酯、卵磷脂等）。使用培養基前，按規定應先檢查其靈敏度和無菌性。培養的溫度和時間也非常關鍵，總之，驗證實驗所采用的培養條件必須要與實際檢驗的培養條件相一致，以保證實驗的真實性與重現性。
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