凡是對微生物學檢測方法驗證實驗產生重大影響的因素，都是在設計驗證方案時需要關注的關鍵因素。這些關鍵因素通常主要是由以下因素構成：①驗證實驗所用微生物的種類及其生理特性；②驗證用微生物接種液的製備；③驗證樣品的預處理方法；以及所有驗證實驗的檢驗方法、檢驗條件和培養條件。因此這些因素也正是影響樣品驗證結果可靠性的關鍵要點。
眾所周知，微生物種類類群繁多，不同種類的微生物其生理生化特性也各不相同。用於驗證的微生物首先要考慮是否具有廣泛代表性，至少包括G+菌、G-菌、酵母菌和黴菌這四類微生物。這幾類微生物基本涵蓋了樣品中可能存在的各類微生物；另一方麵，它們也基本包含了在防腐抑菌效果檢驗試驗中所要使用的試驗菌株。在對控製菌或致病菌的檢查方法進行驗證時，則要求采用與被檢微生物相同的標準菌株作為驗證微生物，這樣針對性與效果會更好。此外，根據驗證實驗的目的，可能還要增加一些在特定環境分離到的菌株用於環境監測方法或無菌檢查方法的驗證。
《中國藥典》（2005年版）規定的驗證用菌株有：大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，乙型副傷寒沙門菌，白色念珠菌，黑曲黴、銅綠假單胞菌，枯草芽孢杆菌，生孢梭菌。
另外，微生物生理生化狀態與製備和培養條件有密切關係，而這些生理生化狀態又直接影響到微生物試驗結果。因為微生物在生長不同時期（如對數期）的營養細胞和衰老細胞、或芽孢的生理生化狀態是不同的，我們試驗研究的是群體細胞，而不可能僅是單個的細胞，隻有群體細胞均勻，生理生化特性趨於一致，實驗結果才會穩定。因此，無論是用於微生物驗證、防腐效力測試或消毒效果檢查的驗證菌株，還是用於常規試驗用的陽性對照菌、培養基靈敏度檢查用的試驗菌，它們的培養基、儲存條件要按既定的標準操作規程進行，製備均勻一致的營養細胞或芽孢，以確保各代微生物營養細胞或芽孢的生理生化狀態保持穩定一致，特征趨於一致。因此選用的試驗菌株應至少包含G+菌、G-菌、酵母菌和黴菌這四大微生物，同時確定選用營養細胞還是芽孢。
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