金黃色葡萄球菌腸毒素與多器官功能障礙綜合征
姚詠明，盛誌勇
(解放軍第三○四醫院燒傷研究所,北京100037)
臨床資料表明,革蘭陽性(G＋)菌膿毒症的發病率逐年上升，至20世紀90年代已達膿毒症發病率的40％以上，並仍有升高趨勢。其中金黃色葡萄球菌(金葡菌)發病率位居首位，是燒傷創麵感染、急性肝衰竭的重要病原菌。由於其致病因素複雜、耐藥性不斷增強，特別是中間型抗萬古黴素金葡菌的出現，金葡菌感染所致膿毒症及多器官功能障礙綜合征(MODS)的防治已成為現代創傷外科和危重病醫學麵臨的棘手難題之一。我們回顧性調查了近5年間從創麵分離的病原菌1 661株，其中金葡菌分離率從1995年的17.7%(居第3位)上升為1999年的29.3%(居第1位)；此外，278例次靜脈內置管的嚴重燒傷患者，7例次發生導管膿毒症(5例死亡)，其分離病原菌中金葡菌占50%以上。由此可見，金葡菌是燒傷感染中最常見的菌種之一，其中耐甲氧西林金葡菌(MRSA)的耐藥性強，易引起膿毒症和MODS等致死性並發症。細菌學研究表明，可溶性外毒素的產生是G＋菌感染的重要標誌之一，在G＋菌感染性疾病的發生、發展中具有重要意義。其中金葡菌腸毒素因其"超抗原"(superantigen)特性以及在中毒性休克綜合征、MODS發病中的特殊意義而倍受關注。
流行病學調查顯示，從我院燒傷患者及醫務人員手和鼻腔中分離出的127株金葡菌中，產毒率高達91.6%，而且以同時產生多種類型毒素者居多〔同時產腸毒素B、C (SEB、SEC)者最為常見〕，其中90%以上為耐藥菌株。北京積水潭醫院檢測100株金葡菌腸毒素產生情況，結果表明總產毒率為68%，其中60株MRSA全部產一種或一種以上腸毒素，而40株非MRSA產毒率僅為20%。上述結果初步提示，產腸毒素金葡菌普遍存在於燒傷患者的創麵、呼吸道，且MRSA較非MRSA有更強的毒力和致病性，對燒傷後並發金葡菌感染構成潛在的威脅。但迄今為止，關於金葡菌腸毒素在燒傷膿毒症及MODS發病中的變化特點及其作用機製尚缺乏足夠的了解，導致這一領域進展緩慢的原因之一是缺乏敏感、快速的金葡菌感染檢測手段。目前臨床上常規的細菌培養與鑒定方法隻能說明是否為金葡菌感染，而金葡菌產毒試驗也僅是觀察細菌在體外的產毒情況，並不能反映其在體內的生物活性及致病特點，且該方法耗時較長，致使金葡菌感染的早期診斷非常困難，誤診的情況時有發生。因此，建立敏感、快速的金葡菌腸毒素檢測方法用以直接監測外毒素在體內的變化特點，將有助於金葡菌感染所致膿毒症及MODS的早期識別與診斷，並可望對金葡菌腸毒素致病機製和臨床意義的認識獲得新的進展。
我們采用改良雙單抗夾心酶聯免疫吸附試驗(BA-ELISA)方法檢測動物血漿及組織勻漿中SEB，利用單克隆抗體的特異性和生物素-鏈親素係統的放大原理，使該方法的檢測靈敏度顯著升高，可達0.078μg/L，檢測範圍為0.078~20.0μg/L，血漿中SEB的回收率為88.7%~106.2%。建立該方法為進一步研究SEB在體內的生物學效應奠定了技術基礎。為此，我們采用大鼠20％體表麵積Ⅲ度燙傷合並金葡菌攻擊所致嚴重膿毒症模型，探討了SEB在膿毒症和多器官功能損害中的變化規律及致病機製。結果顯示，燒傷後金葡菌感染動物血漿SEB水平迅速升高，並於6小時達峰值，其後迅速下降，但至24小時仍明顯高於傷前值；而心、肝、肺、腎等組織中SEB含量持續上升，其中24小時升高幅度最為明顯。與其它組織相比，金葡菌嚴重膿毒症時肝、腎組織中SEB含量明顯高於其它髒器，表明肝、腎可能是SEB蓄積的主要場所。由於SEB可經腎小球自由濾過，並被近端腎小管細胞完全重吸收，因此腎髒在腸毒素清除中的作用可能尤為重要。據報道，腎動脈結紮和腎切除均可導致體內腸毒素的清除延遲，增強其對動物的致死能力。給家兔靜脈注射125I標記的腸毒素A後,循環中腸毒素迅速清除，並分布到肝、腎、肺、脾等組織，其中腎髒含量最高。上述結果進一步證實腎髒是腸毒素蓄積和排泄的最重要場所之一。
研究表明，SEB作為"超抗原"具有很強的絲裂原性，極低濃度即可致T淋巴細胞大量活化、促炎細胞因子產生顯著增加，對金葡菌膿毒症和MODS的病理生理過程可能具有重要的促進作用。我們的資料證實，SEB對家兔肝髒等多個器官的功能具有直接損害效應。為了探討SEB在燒傷膿毒症所致MODS中的作用，我們選取心、肝、肺、腎、腸等重要器官，分析了SEB與器官功能改變的關係。結果顯示，單純燒傷打擊後24小時，動物心、肝、肺、腎功能明顯異常，但反映小腸黏膜完整性的小腸組織二胺氧化酶活性無明顯改變。燒傷合並金葡菌攻擊後動物肝、腎和心功能損害進一步加劇，肺組織中性粒細胞聚集明顯增加；同時，小腸組織二胺氧化酶活性呈持續下降趨勢，提示小腸黏膜的完整性亦嚴重受損。病理形態學檢查證實，燒傷後金葡菌感染動物心、肝、肺、腎、腸等組織均可見不同程度的炎性細胞浸潤和壞死性病變，其中肺髒改變尤為顯著。進一步分析發現，早期給予抗SEB單克隆抗體可有效降低血漿及組織中SEB水平，同時心、肝功能指標顯著降低，小腸組織二胺氧化酶活性基本恢複至傷前範圍。值得注意的是，抗SEB單克隆抗體幹預組動物早期死亡率明顯降低。上述結果表明，隨著組織中SEB含量的降低，動物相應器官功能和預後亦在一定程度上得以改善，從而證實了SEB在MODS中具有重要作用。由此可見，燒傷合並金葡菌攻擊可導致動物多器官功能損害進一步惡化，其改變與髒器組織中SEB含量持續升高密切相關。
業已明確，T淋巴細胞的大量活化是腸毒素所致膿毒症與MODS重要特征之一。而幹擾素-γ(IFN-γ)是活化T淋巴細胞產生的一種強有力的免疫調節因子，在調節單核/巨噬細胞和內皮細胞功能方麵作用顯著。故推測它在金葡菌膿毒症及MODS的病理生理過程中可能具有重要意義。我們的實驗結果顯示，燒傷合並金葡菌攻擊後0.5小時，肝、肺等組織中IFN-γ mRNA表達明顯增加，至24小時仍處於較高水平。與之相似，傷後組織和血漿中IFN-γ含量亦迅速升高。相關分析表明，肺組織IFN-γ水平與肺髒SEB的含量呈顯著正相關，但內毒素的改變與之無相關性。同時，早期給予抗SEB單克隆抗體可顯著抑製血漿及肺組織中IFN-γ的產生，從而證實SEB可能參與了IFN-γ的誘生過程。上述結果表明，燒傷後金葡菌攻擊可導致不同組織中IFN-γ基因及蛋白質表達廣泛上調，其改變與組織SEB的直接刺激作用有關。進一步分析可見，燒傷後金葡菌感染動物肝、肺、腎組織中IFN-γ含量與相應髒器中腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 濃度呈高度正相關，同時肺髒IFN-γ含量與局部組織中一氧化氮水平亦呈正相關關係。表明IFN-γ可通過上調TNF-α和一氧化氮等介質的誘生在金葡菌膿毒症所致MODS中具有促進作用，抗SEB單克隆抗體幹預對動物髒器功能的保護效應與其在一定程度上抑製IFN-γ的產生有關。有資料證實，SEB攻擊小鼠後體內IFN-γ水平明顯升高，並與一氧化氮的過度合成與釋放密切相關；利用抗IFN-γ特異性抗體進行早期拮抗能有效抑製一氧化氮的產生，同時動物預後明顯改善，進一步證實了IFN-γ對機體的損害作用。
金葡菌的致病成分較G－菌更為複雜，包括細菌細胞壁成分、胞外酶和外毒素等多種因子。其中腸毒素為金葡菌產生的主要外毒素之一，它在膿毒症和MODS發生中的作用及其機製日益引起人們的關注。一般認為，腸毒素屬"超抗原"，具有強大的抗原刺激能力，且以T淋巴細胞為主要靶細胞。與普通抗原相似，SEB也可與抗原提呈細胞表麵的主要組織相容性複合物Ⅱ類分子(MHCⅡ)結合形成複合物。其結合部位位於抗原結合槽以外的區域，因此可不經加工直接與T淋巴細胞抗原受體的β鏈V區(TCR Vβ)結合。由於TCR Vβ區僅存在有限的基因，核苷酸序列非常保守，同一個體內的許多T淋巴細胞可具有相同的Vβ成分，因此單一的腸毒素在極低濃度(1~10 μg/L)即可激活大量T淋巴細胞(可達全部T淋巴細胞的5%~10％，甚至40％)。活化的T淋巴細胞釋放大量促炎細胞因子(如TNF-α、IFN-γ)，最終導致炎症失控和MODS的發生。目前研究認為，SEB誘導T淋巴細胞活化有兩種方式，即TCR Vβ限製性方式和不依賴TCR的方式。正常靜息狀態的T淋巴細胞不表達MHCⅡ類分子，SEB必須先與抗原提呈細胞上的MHCⅡ類分子結合，形成毒素-MHCⅡ分子複合物，後者直接與TCR的特異性Vβ鏈結合，經磷酯酰肌醇二磷酸和環磷酸鳥苷等信號轉導途徑誘導T淋巴細胞的活化與增殖，導致炎性細胞因子的大量合成和釋放。與內毒素所致膿毒症及MODS不同，T淋巴細胞活化和增殖產生TNF-α、IFN-γ是介導SEB損傷效應的關鍵環節，而G－菌膿毒症中TNF-α誘生主要由單核/巨噬細胞所介導。
眾多研究證實，急性創、燒傷和休克打擊可導致胃腸道黏膜屏障功能受損、免疫抑製和腸道菌群改變，三者相互作用可促使腸源性內毒素移位至遠隔器官，在燒傷膿毒症和MODS的發病中具有重要意義。有關資料亦顯示，盡管G+菌本身不能產生內毒素，但許多G+菌膿毒症或MODS患者常伴有內毒素血症的出現，並與G+菌致病因子協同致病，對MODS的發生與發展具有促進作用，但其確切的作用機製仍有待探索。動物實驗結果表明，當腸毒素與內毒素共同作用時，可使各自的致死劑量均降低100倍，而且體內TNF-α、IFN-γ和白介素-6(IL-6)等炎症介質的水平更高、持續時間更長。近年來大量研究揭示，腸毒素和內毒素的靶細胞雖各不相同 (分別為T淋巴細胞和單核/巨噬細胞)，但均可通過各自的細胞表麵受體(TCR和CD14)激活細胞內多條信號轉導途徑，最終導致核因子-κB (NF-κB)、信號轉導與轉錄激活子(STAT)等核轉錄因子的活化，後者作為信號轉導途徑的最後"共同通路"，調節著體內多種炎症介質的基因轉錄。由此看來，金葡菌致病因子與內毒素激活炎性細胞的信號轉導存在著某些共同途徑，這可能是二者在膿毒症和MODS發病中具有協同作用的重要病理生理學基礎。以往研究亦證明，腸毒素活化T淋巴細胞產生的IFN-γ作為強有力的免疫調節劑可增強單核/巨噬細胞內信號轉導途徑各種激酶的活化程度，促進TNF-α等炎症介質的合成與釋放，在腸毒素與內毒素的協同作用中起著關鍵的調節作用。進一步觀察發現，IFN-γ可顯著增強脂多糖誘導的核轉錄因子NF-κB的活化、促進其與DNA結合，而脂多糖反過來也可增強IFN-γ所介導的STAT-1的活化，表明二者是通過對信號轉導途徑的交匯調節(cross-regulate)而產生協同效應。此外，TNF-α抗體和IL-1受體拮抗劑可有效抑製IFN-γ和脂多糖的協同效應，表明IFN-γ和脂多糖介導生成的TNF-α、IL-1等細胞因子本身還可通過"自分泌環"對協同效應起到一定的促進作用。由此可見，在金葡菌感染誘發膿毒症和MODS病理過程中，腸毒素、內毒素及其介導的細胞因子在信號轉導水平相互調節、相互促進，可能是協同效應的發生機製之一。應當指出的是，創、燒傷後金葡菌的致病因子較為複雜，除腸毒素外，金葡菌細胞壁成分(如肽聚糖和磷壁酸)在失控性炎症反應及MODS中的地位亦不容忽視，其確切的病理生理意義有待於深入探討。
作者簡介：姚詠明(1965-),男(漢族),湖北省人,博士後,教授。主要從事創傷休克、膿毒症和多器官功能障礙綜合征發病機製及防治的研究。
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