用特異熒光染料（Hoechst33258）染色後在熒光顯微鏡下進行檢測。熒光染料（Hoechst33258）是一種能和DNA特異結合的物質。如果檢測樣品為支原體汙染，則附在細胞表麵的支原體DNA著色，在熒光顯微鏡下可見。
1、儀器設備及製劑的配製
（1）儀器熒光顯微鏡，CO2培養箱，細胞培養六孔板或其他容器。
（2）培養基：DMEM完全培養基及無抗生素的DMEM培養基。
（3）試劑
①二苯甲酰胺熒光染料（Hoechst33258）濃縮液：稱取5mg二苯甲酰胺熒光染料，加入100ml不含碳酸氫鈉的Hanks液中，室溫下磁力攪拌30—40min，使其完全溶解，-2℃避光保存。
②二苯甲酰胺熒光染料（Hoechst33258）工作液：量取100ml無酚紅和碳酸氫鈉的Hanks液，加入1ml二苯甲酰胺濃縮液混勻。
③固定液：乙酸：甲醇（1：3）混合液。
2、檢查方法
（1）取出：蓋玻片培養細胞匯合前從瓶中取出：細胞最好處於70%匯合，如細胞完全匯合，能影響支原體的觀察。
（2）漂洗：將細胞蓋片置於培養皿中，用不含酚紅的Hanks液漂洗；細胞懸液則先離心去上清營養液後，再加入Hanks液漂洗。
（3）固定：加入固定液5ml，放置10min。
（4）漂洗：用生理鹽水或去離子水漂洗，方法同（2）。
（5）染色：加入二苯甲酰胺熒光染料工作液5ml，在室溫下放置10min。
（6）漂洗：吸出染液，用5ml水洗3次。
（7）觀察：取出蓋玻片空氣中幹燥，細胞麵向上，滴加pH5.5的磷酸緩衝液數滴，覆以蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。
3、結果判定
陽性結果：可見細胞周圍或細胞膜上有大小不等、不規則熒光著色顆粒（綠色小點）。
當陰性結果和陽性結果均成立時，實驗有效。如懷疑可疑，應重做。
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