由於支原體種類不同，應采取不同的方法進行檢測，常用的方法有如下幾種。
1、觀察細胞的形態和生長特征
支原體汙染比較嚴重時可出現生長減慢，有的培養基pH明顯變酸，並出現細胞病變，其病變特征與病毒感染相似，因此不能準確診斷。
2、分離培養法
大多數支原體可出現特有的典型菌落。該方法準確、可靠，但時間長，敏感性不夠高。
3、DNA結合熒光素染色法
此法簡便、價廉，但若細胞片製備不當則結果難以判斷。
4、電子顯微鏡和免疫電子顯微鏡法
此法較準確，但受條件限製，時間長，敏感性不高。
5、間接免疫熒光法和免疫印跡
簡便、快速、特異性強，如果應用單克隆抗體試劑，效果會更好。
6、PCR技術
快速、敏感性高，但若條件控製不當容易出現假陰性和假陽性。
7、其他方法
放射性核素摻入法、放射自顯影法、基因探針法等。
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