1、材料
Dienes染色液,1.5%毛地黃皂苷液。
2、方法
(1)Dienes菌落染色:Dienes染色液是將2.5g亞甲藍、1.5g天青II、10g麥芽糖、0.5g碳酸鈉溶於100ml蒸餾水中。染色時直接吸入染色液覆蓋菌落上1min左右,用生理鹽水洗去染色液後,在低倍顯微鏡下可見支原體菌落成藍色,其他細菌菌落不著色,容易鑒別。
(2)毛地黃皂苷敏感性試驗:用95%酒精配製1.5%毛地黃皂苷液,56℃水浴加熱使完全溶解。然後將此溶液浸濕滅菌的小圓濾紙。37℃使幹燥,置冰箱保存使用。將待檢支原體菌液塗種於固體培養基上,再將上述毛地黃皂苷紙片放於接種培養基上,培養3—5d後,低倍鏡下觀察菌落生長情況。若有抑製帶出現,帶寬>2mm的為支原體,帶寬<2mm為無甾醇原體。
(3)生化反應試驗:常利用發酵葡萄糖、水解精氨酸、水解尿素等生化反應鑒別支原體。
表 人類支原體的生化反應
支原體 是否需要 分解 水解 水解 還原 吸附
膽固醇 葡萄糖 精氨酸 尿索 四氮唑 血細胞
發酵支原體 + + + — — —
肺炎支原體 + + — — — —
溶脲脲原體 + — — + — +
人型支原體 + — + — — —
生殖支原體 + + — — — +
唾液支原體 + — + — — —
口腔支原體 + + + — — —
穿通支原體 + + + — — +
(4)血細胞吸附試驗:在平板瓊脂培養基上生長的支原體菌落滴上豚鼠紅細胞懸液,人體的某些支原體有吸附作用。
(5)生長抑製試驗:用直徑6—8mm的圓形滅菌濾紙片,用未經稀釋的抗血清濕透後,放入無菌平板內,於4℃下幹燥待用。吸取待檢菌株的菌液0.5ml塗布於固體培養基上,放置37℃使瓊脂表麵稍幹燥 。無菌操作夾取抗血清紙片貼於瓊脂表麵,37℃培養4—5d。在低倍鏡下觀察,當濾紙片周圍無菌落生長,出現抑菌圈大於2mm者表示該菌與抗血清的免疫原同一菌種,小於2mm為異種。試驗時應該設立陰性對照組和陽性對照組。
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